正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化刺三加根中總多酚的提取工藝研究

高林曉，郭蒙，郭茂鴻，趙前程，吳偉，楊再波

（1．黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州都勻558000；2．貴州省普通高校民族藥用植物資源開發(fā)工程研究中心，貴州都勻558000）

刺三加[Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.]，屬于五加科五加屬攀援狀灌木，又名苦刺芽、刺三甲、白簕、三甲皮、雞腳菜、苦粉竻和苦刺芯等。其性平，辛微苦涼，氣微香，廣泛分布于我國中南部地區(qū)。刺三加根和皮作為藥物使用已經(jīng)有悠久的歷史，特別在東南亞一帶，把刺三加根作為與人參同樣功效的藥物使用，具有祛風(fēng)逐濕、散瘀止痛、舒筋活血、消腫解毒和止咳平喘等功效[1-3]。相關(guān)文獻(xiàn)對刺三加葉中化學(xué)成分、藥理作用和毒理活性等方面作了比較系統(tǒng)的歸納總結(jié)，其主要的有效化學(xué)成分包括皂苷類、黃酮類、揮發(fā)性成分、多糖類等[4-8]，但有關(guān)刺三加根中多酚的提取工藝優(yōu)化和含量測定的研究鮮有報(bào)道。

研究表明植物多酚具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降血脂、預(yù)防癌癥和清除自由基等功能[9-10]，其提取分離工藝研究越來越引起人們的重視。植物多酚傳統(tǒng)的提取方法有煎煮法、滲漉法、有機(jī)溶劑法以及回流提取法等，這些傳統(tǒng)的方法提取效率低、有效成分損失太多，存在雜質(zhì)較多、影響藥效等缺點(diǎn)；現(xiàn)代提取方法有超聲輔助提取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法以及超臨界流體萃取法等，與傳統(tǒng)提取方法相比，這些現(xiàn)代提取方法具有提取物純度高，操作簡單，收率高，節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)[11]。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇超聲輔助提取的方法。目前，針對總多酚各物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而發(fā)展的含量測定方法主要有福林酚法[12-14]、高效液相色譜法[15-16]、高錳酸鉀滴定法[17]、酒石酸亞鐵分光光度法[18]和鐵氰化鉀分光光度法[19-20]等，由于比色法簡單、成本低、分析速度快，因此，本試驗(yàn)選用酒石酸亞鐵法測定刺三加根中總多酚含量，并以總多酚的提取率為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選出最佳提取工藝條件，為刺三加總多酚的合理利用和藥用部位的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺三加根采自廣東恩平，經(jīng)黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院黃小娜副教授鑒定為五加科五加屬植物刺三加根。采后于45 ℃烘干，粉碎過60 目篩，封口包裝。置閉光、陰涼處存放，待用。

沒食子酸對照品（純度≥98%，批號：BM170623）：合肥博美生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試有限公司；無水磷酸二氫鈉（分析純）：天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；硫酸亞鐵（分析純）：重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177 高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；DL-360D 智能超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司；80-1 電動離心機(jī)：金壇市城東新瑞儀器廠；BS110S 電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺三加根前處理及總多酚提取

準(zhǔn)確稱取15.00 g 干燥、粉碎、過60 目篩后的刺三加根粉末，置于250mL錐形瓶中，室溫下，加150 mL石油醚對其進(jìn)行浸泡，使刺三加根粉末中的油脂溶解到石油醚中，也可以去除大多數(shù)溶劑型的有機(jī)物色素，重復(fù)2 次，至石油醚層幾乎無色，第二次進(jìn)行抽濾，傾去醚液，濾渣樣品置于通風(fēng)處自然干燥備用。準(zhǔn)確稱取一定量的上述干燥的濾渣樣品，加入一定料液比的乙醇水溶液，置于超聲波中，在一定溫度下提取一定時(shí)間后，將提取液冷卻、離心、分離，取上清液即得樣品總多酚提取液。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取 0.5 g 硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）和 2.5 g 酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O8·4H2O），加蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻[21]，得酒石酸亞鐵溶液。

準(zhǔn)確稱取60.012 3 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和10.265 9 g 無水磷酸二氫鈉，用蒸餾水溶解，并轉(zhuǎn)移定容至1 000mL容量瓶中，搖勻，得pH 值為7.5 磷酸鹽緩沖液，常溫保存，備用。

準(zhǔn)確稱取食子酸對照品0.125 2 g，置于250mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容至刻度，搖勻，即得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為0.500 8 mg/mL。

分別精密移取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的0.500 8 mg/mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至體積到5.0 mL，再加入酒石酸亞鐵溶液5.0 mL，用pH 值為7.5 的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，混勻，室溫下靜置15 min，以試劑空白為參比，在540 nm 處測定其吸光度[22]。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（C，mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性回歸方程：A=13.045 6 C+0.023 5（r=0.999 5）。研究結(jié)果表明，沒食子酸濃度在0.004 mg/mL～0.060 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

1.3.3 刺三加根中總多酚含量測定方法

準(zhǔn)確移取2.0mL樣品提取液于容量瓶中，依次加蒸餾水至體積到5.0 mL，酒石酸亞鐵溶液5.0 mL，用pH 值為7.5 的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，混勻，室溫下靜置15 min，以試劑空白為參比，在540 nm 處測定吸光度值。并根據(jù)沒食子酸線性回歸方程計(jì)算樣品提取液中總多酚含量，同時(shí)平行試驗(yàn)3 次。按下式計(jì)算總多酚提取率：總多酚提取率/%=樣品提取液中總多酚含量/樣品質(zhì)量×100。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

按照1.3.1 和1.3.3 中的試驗(yàn)方法對刺三加根中的總多酚進(jìn)行提取和含量測定，固定超聲波的功率為100 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別取30%、45%、60%、75%、90%；料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）；超聲時(shí)間為 15、30、45、60、75 min；超聲溫度為 20、30、40、50、60 ℃，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4 個(gè)因素對刺三加根中總多酚提取率的影響[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳吸收波長的確定

精密吸取按最優(yōu)條件提取的刺三加根樣品溶液2.0 mL、沒食子酸對照溶液1.5 mL，分別置于25mL容量瓶中，依次各加入蒸餾水至體積到5.0 mL，酒石酸亞鐵溶液5.0 mL，用pH 值為7.5 的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，混勻，室溫下靜置15 min，以試劑空白為參比，在波長為400 nm～850 nm 范圍內(nèi)掃描吸收光譜見圖1。

圖1 吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum

由圖1 可知，刺三加根中總多酚的最大吸收波長是540 nm，與對照溶液沒食子酸反應(yīng)后產(chǎn)物的最大吸收波長一致。由此本試驗(yàn)的最佳吸收波長選擇為540 nm。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對刺三加根中總多酚提取的影響

在料液比 1∶30（g/mL）、提取時(shí)間 30 min、提取溫度30 ℃條件下，采用乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、45%、60%、75%、90%的溶劑進(jìn)行超聲輔助提取，總多酚提取率結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總多酚提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total polyphenols

由圖2 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總多酚的提取率呈下降趨勢，可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)大時(shí)，乙醇引起蛋白質(zhì)變性在細(xì)胞壁形成致密結(jié)構(gòu)間接阻礙了多酚物質(zhì)的溶出，也有可能是因?yàn)樘崛∪軇┮掖寂c多酚之間的極性差異增大，導(dǎo)致總多酚的提取率呈下降趨勢。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%。

2.2.2 料液比對刺三加根中總多酚提取的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、提取溫度30 ℃、提取時(shí)間30 min，料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的條件下，考察不同料液比對刺三加根中總多酚提取效果的影響，總多酚提取率結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對總多酚提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid rate on the extraction rate of total polyphenols

由圖3 可知，當(dāng)料液比為 1∶30（g/mL）時(shí)，總多酚的提取率達(dá)到最大，隨后又減小，可能是因?yàn)楫?dāng)乙醇體積達(dá)到足夠大時(shí)，多酚可以全部溶出；當(dāng)刺三加根粉末的量過大時(shí)，只有部分多酚溶出，導(dǎo)致多酚的提取率下降。因此，選擇料液比為1∶30（g/mL）。

2.2.3 提取時(shí)間對刺三加根中總多酚提取的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù) 45%、料液比 1∶30（g/mL）、提取溫度30 ℃條件下，考察超聲輔助提取時(shí)間對刺三加根中總多酚提取效果的影響，總多酚提取率結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對總多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of total polyphenols

由圖4 可知，在 15 min～45 min 內(nèi)，刺三加根中總多酚提取率呈迅速增加的趨勢，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到45 min時(shí)，總多酚的提取率達(dá)到最大值。但超過45 min 后，多酚提取率則呈下降趨勢，其原因可能是隨著超聲輔助提取時(shí)間的延長，會使得一些醇溶性雜質(zhì)成分的溶出量增加，這些成分與多酚類化合物競爭同乙醇分子的結(jié)合，從而導(dǎo)致多酚提取率下降[23]。因此，選擇超聲輔助提取時(shí)間為45 min。

2.2.4 提取溫度對刺三加根中總多酚提取的影響

準(zhǔn)確稱取0.5 g 樣品5 份，加入45%的乙醇溶液15mL，分別在 20、30、40、50、60 ℃超聲輔助提取 45 min，提取液冷卻后離心分離，取上清液進(jìn)行測定，計(jì)算總多酚的提取率，總多酚提取率結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對總多酚提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total polyphenols

由圖5 可知，超聲溫度從20 ℃增加到50 ℃時(shí)，總多酚提取率呈增加趨勢，后隨著溫度增加，總多酚提取率有所下降，可能是溫度過高，總多酚的分子結(jié)構(gòu)受到破壞，從而導(dǎo)致總多酚提取率下降，故選擇超聲輔助提取的溫度為50 ℃。

2.3 正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定4 個(gè)因素的合理水平，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

以刺三加根中總多酚的提取率為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化總多酚最佳超聲輔助提取工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experiment

由表2 分析可知，極差最大的為D 因素，影響刺三加根中總多酚提取率的主次因素為：D＞B＞C＞A，即在一定范圍內(nèi)，超聲輔助提取溫度對總多酚提取率影響最大，然后依次是料液比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)。各因素的最佳組合為D3B2C2A1，即提取條件為提取溫度 60 ℃、料液比 1∶30（g/mL）、提取時(shí)間 45 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為35 %。此條件下多酚的提取率最高為1.37%，高于正交試驗(yàn)中每次試驗(yàn)的測定結(jié)果。

為了進(jìn)一步確定各因素對刺三加根中總多酚提取效果的影響，對表2 結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，由于A 因素的R 值最小，將其作為空白列進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表3。由表3 可以看出，料液比和超聲溫度對結(jié)果的影響是顯著的，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對結(jié)果并無顯著影響。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance for the result of orthogonal experiment

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度試驗(yàn)

精密移取1.5mL沒食子酸對照溶液6 份，按照1.3.3 試驗(yàn)方法測定，記錄其吸光度，計(jì)算得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為 0.83%（n=6），這表明儀器精密度是良好的。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的刺三加根6 份，按最佳提取條件制備樣品提取液，按照1.3.3 試驗(yàn)方法測定其吸光度，計(jì)算吸光度的RSD 為1.38%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次的樣品提取液，分別在 0.25、1、2、4、6、8、12 h 按1.3.3 的試驗(yàn)方法測定其吸光度，結(jié)果表明，溶液顯色后0.25 h～12 h 時(shí)間內(nèi)樣品溶液的吸光度變化不大，計(jì)算其RSD 為0.69%，說明這12 h 內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性良好。

2.4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

按最佳提取條件平行制備樣品提取液6 份，各準(zhǔn)確吸取1.5mL樣品溶液，置25mL棕色容量瓶中，按1.3.3 項(xiàng)下試驗(yàn)方法，測定其吸光度，并計(jì)算總多酚含量。從上述6 份樣品溶液中各移取1.5 mL，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，置25mL棕色容量瓶中，按1.3.3 項(xiàng)下試驗(yàn)方法，測定其吸光度，并計(jì)算總多酚含量，結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experiment results of average recovery

由表4 可知，總多酚平均回收率為99.59%，RSD為1.27%。

2.5 樣品含量測定

結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果分析，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù) 35 %、料液比 1∶30（g/mL）、提取時(shí)間45 min、提取溫度60 ℃的條件下，制備樣品提取液，同時(shí)測定其吸光度，代入線性回歸方程計(jì)算總多酚含量，并計(jì)算總多酚提取率，結(jié)果見表5。

由表5 可知，其總多酚平均值為13.45 mg/g，RSD（n=6）為1.38%，總多酚提取率平均值為1.34%。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)選擇乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取刺三加根中總多酚。通過單因素試驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲輔助提取刺三加根中總多酚的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間45 min、提取溫度60 ℃，在此條件下，總多酚的提取率最高，平均值為1.34%。

總多酚的含量測定方法有高錳酸鉀、福林酚、鐵氰化鉀分光光度、高效液相色譜和酒石酸亞鐵等方法，由于高錳酸鉀滴定法滴定終點(diǎn)較難觀察；福林酚法靈敏度較高，簡便易行，但對環(huán)境溫度要求高；鐵氰化鉀分光光度法對時(shí)間敏感，且顯色穩(wěn)定時(shí)間短，對測定條件要求嚴(yán)格；高效液相色譜法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，分析成本高，儀器價(jià)格及日常維護(hù)費(fèi)用貴。因此，本試驗(yàn)選用酒石酸亞鐵分光光度法測定刺三加根中總多酚的含量。結(jié)果表明，該方法操作簡單易行，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，精密度高，可用于刺三加根中總多酚的含量測定。