鷹嘴豆醇提物降血糖作用研究

王德萍，安馨，魚曉敏，于睿，王興婷，江巖

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046；2.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院四川省動物源性食品獸藥殘留防控技術(shù)工程實驗室，四川成都610050）

鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）因形如鷹嘴，故名鷹嘴豆，在全球是僅次于大豆的消費(fèi)豆類[1-3]?！毒S吾爾藥志》記載，鷹嘴豆具有“清除異常體液，開通體液閉阻，調(diào)節(jié)機(jī)體等作用”，用于身體瘦弱、食欲不振、皮膚瘙癢及糖尿病等疾病的治療[4]。祖國中醫(yī)認(rèn)為，鷹嘴豆“味甘、性平、無毒”，具有補(bǔ)中益氣、溫腎壯陽功效，享有“長壽豆”的美譽(yù)，在糖尿病、高脂血癥等慢性疾病的防治具有悠久的歷史[5-6]。

糖尿病發(fā)病率逐年升高且愈來愈年輕化，長期服用西藥會造成機(jī)體胰島素受體敏感性降低，產(chǎn)生胰島素抵抗等一系列毒副作用[7]。從天然藥食兩用植物中制備高效、安全、低毒的降血糖藥物具有很好的前景。

新疆木壘縣是國內(nèi)最大鷹嘴豆種植基地，但其研發(fā)仍處于豆粉等低附加值農(nóng)產(chǎn)品加工，基礎(chǔ)研究滯后。本文將鷹嘴豆醇提物喂飼糖尿病小鼠4 周，測定血糖、血清胰島素水平等指標(biāo)，觀察胰腺組織病理變化，探討鷹嘴豆醇提物降血糖效應(yīng)。以期促進(jìn)新疆特色植物資源鷹嘴豆開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級昆明種小鼠：新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2016-0003，52 只，雄性，體重（20±2）g，新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素：Sigma 公司；胰島素酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 測試盒：廣州威佳科技公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、總超氧化物歧化酶（totalsuperoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒：南京建成生物研究所。

S-752 紫外可見分光光度計：上海菁華科技公司；RT-6100 RayTo 酶標(biāo)分析儀：深圳雷杜生命科技公司。

1.3 方法

1.3.1 鷹嘴豆乙醇提取物（醇提物）制備與成分測定

將鷹嘴豆粉碎，過40 目篩，石油醚回流脫脂，干燥。在乙醇濃度 50%、提取溫度 50 ℃、液料比 30∶1（mL/g）的條件下浸提鷹嘴豆，重復(fù)提取2 次，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥得鷹嘴豆醇提物。

分別采用蒽酮-硫酸法[8]、三波長紫外分光光度法[9]、香草醛-高氯酸比色法[10]、考馬斯亮藍(lán)法[11]測定鷹嘴豆醇提物中多糖、異黃酮、皂苷及蛋白質(zhì)的含量。參照GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》直接干燥法測定水分；參照GB 5009.10-2003《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物類食品中粗纖維的測定》稱重法測定粗纖維；參照GB/T 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》索氏抽提法測定粗脂肪。

1.3.2 建立糖尿病小鼠模型

取健康、雄性昆明種小鼠52 只，在實驗環(huán)境下給予基礎(chǔ)飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。隨機(jī)選取12 只作為空白對照組，給予緩沖液，其余40 只小鼠腹腔注射streptozocin 溶液[180 mg/（kg·d·BW）]，72 h 后測體重，尾尖取血測定空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L 為造模成功。

1.3.3 動物實驗分組

A 組：空白對照組（12 只）；40 只糖尿病小鼠按體重隨機(jī)分為 5 組，每組 8 只：B 組：模型對照組；C 組：陽性藥物對照組（二甲雙胍）；D 組：鷹嘴豆醇提物低劑量組；E 組：鷹嘴豆醇提物中劑量組；F 組：鷹嘴豆醇提物高劑量組；每組8 只。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃～27 ℃，相對濕度 50%～70%，12 h 明暗交替，每籠 6 只，自由進(jìn)食、飲水。A 組和B 組灌胃等體積蒸餾水；C～F 組分別灌胃不同劑量的受試物，共計4 周。

表1 動物實驗分組情況Table 1 Experiments of mice grouping

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 小鼠血糖、血清胰島素水平測定

尾尖取血測定小鼠空腹血糖值。采用ELISA 法測定血清胰島素水平，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度OD 值，計算樣品濃度。并按公式1、2 計算穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment insulin resistance index，HOMA-IR）、胰島素敏感性指數(shù)（quantitative insulin sensitivity check index，QUICKI）。

式中：FBG 為空腹血糖水平，mmol/L；FINS 為胰島素水平，mIU/mL。

1.4.2 小鼠血清氧化-抗氧化水平測定

根據(jù)試劑盒說明書測定小鼠血清中抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 活性及過氧化脂質(zhì) MDA 含量，評價各組小鼠機(jī)體氧化-抗氧化水平。

1.4.3 小鼠肝臟、胰腺病理切片觀察

取小鼠肝臟、胰腺組織，采用甲醛固定；常規(guī)洗滌、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosinstaining，HE）染色，光鏡下觀察組織病理變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 鷹嘴豆醇提物成分分析結(jié)果

鷹嘴豆醇提物成分分析結(jié)果見表2。

表2 鷹嘴豆醇提物成分分析結(jié)果Table 2 Composition of chickpea ethanol extracts

2.2 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血糖水平的影響

鷹嘴豆醇提物對小鼠血糖水平的影響見表3。

表3 鷹嘴豆醇提物對小鼠血糖水平的影響Table 3 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's blood glucose level

表3 顯示，空白組小鼠與模型組糖尿病小鼠血糖水平在實驗期間均較穩(wěn)定。實驗結(jié)束時，鷹嘴豆醇提物低、中、高組血糖水平分別為模型組的83.4%、60.0%、67.9%（P＜0.05），以中劑量組降血糖效果最為顯著，該組血糖水平與陽性藥物二甲雙胍十分接近，無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響見表4。

表4 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響Table 4 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's blood insulin levels

表4 顯示，模型組糖尿病小鼠血清胰島素水平是空白組的2.74 倍（P＜0.05），呈胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。而鷹嘴豆醇提物各組胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)呈下降趨勢，而胰島素敏感指數(shù)明顯增強(qiáng)（P＜0.05），以中劑量組效果最好，胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)及胰島素敏感指數(shù)分別是模型組的39.74%、31.09%及1.22 倍。

2.4 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清氧化-抗氧化水平的影響

鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清氧化-抗氧化水平的影響見表5。

表5 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠血清氧化-抗氧化水平的影響Table 5 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's sera antioxidants activities

由表5 可知，與空白組相比，模型組MDA 含量升高，抗氧化酶活性不同程度降低（P＜0.05）。鷹嘴豆醇提物干預(yù)4 周后，糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性均有所提高，以中劑量組作用較為明顯，T-SOD、GSH-Px、CAT 活性及 MDA 含量分別是模型組的 1.09、1.03、1.36 倍及76.4%。

2.5 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠肝臟組織、胰腺組織的影響

鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠肝臟組織影響見圖1。

圖1 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠肝臟組織影響的形態(tài)學(xué)觀察（HE染色 40×10）Fig.1 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's liver morphology（HE staining 40×10）

圖1 顯示，空白組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)、大小正常，核內(nèi)染色質(zhì)均勻。模型組糖尿病小鼠肝細(xì)胞腫大壞死，伴有脂肪空泡，出現(xiàn)脂肪變性。鷹嘴豆醇提物各組糖尿病小鼠肝細(xì)胞脂肪變性呈現(xiàn)不同程度的改善，以中劑量組作用最為明顯，該組糖尿病小鼠肝細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)趨于正常，脂肪空泡明顯減少。

鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠胰腺組織影響見圖2。

圖2 鷹嘴豆醇提物對糖尿病小鼠胰腺組織影響的形態(tài)學(xué)觀察（HE 染色 40×10）Fig.2 Effects of chickpea ethanol extracts on diabetic mice's pancreas morphology（HE staining 40×10）

圖2 顯示，空白組小鼠胰島細(xì)胞數(shù)量較多，胞漿致密，細(xì)胞完整性好。模型組糖尿病小鼠胰島細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，胞漿萎縮明顯，出現(xiàn)條帶狀空白區(qū)。鷹嘴豆醇提物各組糖尿病小鼠胰島細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同程度的改善，以中劑量組作用最為明顯，該組糖尿病小鼠胰島細(xì)胞體積較大，形態(tài)相對規(guī)則，胞質(zhì)豐富，結(jié)構(gòu)與空白組相似。

3 結(jié)論與討論

正常機(jī)體受胰島β 細(xì)胞和肌肉、脂肪等胰島素敏感組織構(gòu)成的反饋環(huán)對血糖進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)胰島素分泌不足時，肌肉、脂肪等外周胰島素效應(yīng)細(xì)胞對葡萄糖攝取能力下降，造成胰島素抵抗，血糖將維持在較高水平[12-13]。因此，改善胰島素抵抗作用，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞對葡萄糖利用，可以達(dá)到降血糖效果。大量研究證實，氧化應(yīng)激損傷、過多的游離脂肪酸均可誘發(fā)胰島素抵抗[14]。天然產(chǎn)物中的黃酮、多糖、皂苷等化合物，可通過清除自由基、調(diào)節(jié)血脂等，多途徑改善胰島素抵抗現(xiàn)象，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞對葡萄糖利用，可以達(dá)到降血糖效果[15-17]。

薛峰[18]研究表明，鷹嘴豆異黃酮可通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性，清除自由基及過氧化物產(chǎn)物，減輕細(xì)胞氧化損傷，促進(jìn)胰腺等功能恢復(fù)，從而增強(qiáng)機(jī)體對葡萄糖攝取利用，發(fā)揮降血糖效應(yīng)。凱賽爾[19]用鷹嘴豆總皂苷干預(yù)糖尿病大鼠，大鼠的胰島形態(tài)趨于規(guī)則，胰島細(xì)胞有所增加，提示鷹嘴豆總皂苷通過修復(fù)受損胰島細(xì)胞，促進(jìn)胰島素分泌，從而發(fā)揮其降血糖作用。趙堂彥等[20]報道鷹嘴豆水提物中的異黃酮與皂苷在體外對α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制作用。傅建云等[21]用鷹嘴豆多糖干預(yù)糖尿病小鼠后，可提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活力，清除脂質(zhì)過氧化物，修復(fù)四氧嘧啶對小鼠胰島損傷；并且增強(qiáng)肝臟、肌肉等效應(yīng)細(xì)胞對胰島素敏感性，減輕胰島素抵抗，通過多途徑發(fā)揮降血糖效應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，鷹嘴豆醇提物明顯降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖水平，減輕胰島素抵抗，增強(qiáng)胰島素敏感性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性。綜合上述學(xué)者關(guān)于鷹嘴豆降血糖效應(yīng)研究，本實驗鷹嘴豆醇提物中的異黃酮、多糖、皂苷等生物活性物質(zhì)發(fā)揮了降血糖效應(yīng)，可能的作用機(jī)理如下：（1）提高機(jī)體抗氧化酶活性：清除自由基，減輕鏈脲佐菌素引發(fā)氧化損傷，修復(fù)肝臟、胰島受損結(jié)構(gòu)與功能，促進(jìn)胰島素分泌，發(fā)揮其降血糖效應(yīng)。（2）上調(diào)胰島素信號通路基因表達(dá)：鷹嘴豆醇提物可能通過促進(jìn)胰島素信號通路中關(guān)鍵基因表達(dá)，促進(jìn)胰島素分泌，并增強(qiáng)肌肉、肝臟等效應(yīng)細(xì)胞對胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞對葡萄糖的攝取與利用，發(fā)揮其降血糖效應(yīng)。鷹嘴豆醇提物降血糖作用機(jī)制仍有待深入研究。