60 Hz低頻電磁場對α-淀粉酶催化效率的影響及作用機(jī)理

楊 慧,林日輝,*,樊艷葉,廖安平,蔡杏華,韋世昌,廖成超

(1.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,廣西高?；瘜W(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530006;2.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院,廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530006;3.廣西民族大學(xué)相思湖學(xué)院,廣西南寧 530006)

淀粉的水解產(chǎn)物主要有糊精、麥芽糖、葡萄糖[1],其中葡萄糖廣泛應(yīng)用于工業(yè)、食用及醫(yī)藥等領(lǐng)域[2-3]。國內(nèi)外比較常用的淀粉糖化工藝主要有3種:酸法、酶解法及酸酶法[4-5],其中酶解法具有反應(yīng)條件溫和,設(shè)備簡單,催化效率高,產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)[5]。目前,酶法制備淀粉水解糖普遍存在反應(yīng)時間長、能耗及生產(chǎn)成本高等問題[3,5],因此,提高酶促反應(yīng)效率,有效縮短淀粉水解反應(yīng)時間具有現(xiàn)實(shí)意義。劉洪等[5]報道微波-雙酶耦合催化淀粉的水解率比水浴加熱提高20%以上。石文奇等[6]在超聲波對液體α-淀粉酶酶學(xué)活性的影響研究中,利用適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚恙?淀粉酶,其酶活性最大可提高13%,退漿率提高約10.2%。但微波和超聲波的機(jī)械強(qiáng)度過高,容易破壞酶的活性中心,使酶失活,而且由于微波的熱效應(yīng)難以有效控制及超聲波的衰減因素的制約,微波和超聲波難以應(yīng)用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

低頻電磁場(low frequency electromagnetic field,LF-EMF)是指頻率在0～300 Hz范圍內(nèi)的交變電磁場,其中工頻電磁場(50～60 Hz)是在LF-EMF中應(yīng)用最為廣泛一類電磁場[7]。薛麗萍等[8]利用低電頻電磁場對過氧化氫酶進(jìn)行處理,酶活性及酶構(gòu)象均發(fā)生改變,當(dāng)處理溫度為55 ℃時,最高酶活可提高100%以上,其二級結(jié)構(gòu)向α-螺旋轉(zhuǎn)變。張秋霞等[9]發(fā)現(xiàn)用0.1 T的磁場處理脂肪酶1 h可使酶活力提高76.1%。肖祖峰等[10]認(rèn)為電磁場可降低傳質(zhì)過程的活化能,強(qiáng)化擴(kuò)散。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn),在頻率為60 Hz低頻電磁場作用下,釀酒酵母生長速率提高了14.52%,葡萄糖消耗加快了15.6%,胞內(nèi)乙醇脫氫酶(ADH)和超氧化物歧化酶(SOD)的比活力分別提高了7.25%和43.18%,有效促進(jìn)釀酒酵母的生長代謝[11]。目前利用LF-EMF提高酶促反應(yīng)效率的研究鮮見報道,且提高催化效率,縮短反應(yīng)時間,降低能耗一直是工業(yè)上對酶制劑應(yīng)用的追求目標(biāo),所以為了拓展LF-EMF的應(yīng)用范圍,提高酶催化效率,探索LF-EMF的作用機(jī)理,本文以α-淀粉酶催化水解玉米淀粉為研究對象,在反應(yīng)過程中加入頻率為60 Hz LF-EMF,探討LF-EMF輻射對α-淀粉酶催化效率的影響,并進(jìn)一步分析LF-EMF輻射對玉米淀粉的形貌及結(jié)晶度、α-淀粉酶結(jié)構(gòu)及傳質(zhì)過程等方面的影響,探究LF-EMF的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 食品級,廣西南寧旺蜀商貿(mào)有限責(zé)任公司;α-淀粉酶(≥500 KNU/g)生物試劑 阿拉丁試劑(上海)有限公司;3,5-二硝基水楊酸、濃鹽酸 分析純,成都市科龍化工試劑廠;氯化鈉 分析純,天津市博迪化工有限公司;Tris堿 分析純,北京索萊寶科技有限公司;N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺 分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司;檸檬酸 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;磷酸氫二鈉 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

電場發(fā)生裝置(DENBA～08,功率為3.3 W,頻率為60 Hz,電場強(qiáng)度為2.5 mV/m,有效輻射范圍8 m3) 日本株式會社;SUPRA 55 Sapphire場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司;UItime IV組合型X射線衍射儀 日本理學(xué)公司;L400型高速冷凍離心機(jī)、F-700型熒光光度計 日本日立公司;WIX-miniPR02型垂直電泳槽 韋克斯科技有限公司;EPS301型電泳儀 瑞士Amershan Biosciences公司;GeIDOC XR凝膠電泳成像分析系統(tǒng) 美國BIO RAD公司;Chirascanq CD圓二色CD光譜儀 英國應(yīng)用光物理公司;MQL-61R立式振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司;DDS-307型電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LF-EMF對α-淀粉酶催化效率的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)置輻射及對照兩組(每個實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)三個平行),輻射反應(yīng)組采用60 Hz LF-EMF進(jìn)行輻射(放入搖床前開啟輻射),對照組則不作輻射處理。實(shí)驗(yàn)組與對照試驗(yàn)的反應(yīng)體系均含玉米淀粉1.00 g,50 mmol/L pH為6.4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液50 mL,置于150 mL錐形瓶,加入α-淀粉酶100 μL在150 r/min,40 ℃恒溫?fù)u床中反應(yīng)。

采用DNS法測定水解產(chǎn)生的葡萄糖濃度[12-13],每隔2 h取樣1 mL,8000 r/min離心5 min,取上清100 ℃水浴加熱3 min,經(jīng)無菌水稀釋相應(yīng)倍數(shù),然后按照1∶1的體積之比與DNS試劑充分混勻,100 ℃水浴加熱5 min,冷卻至室溫后,在540 nm波長下檢測吸光值。葡萄糖的濃度計算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.456x-0.3676(R2=0.9995)。

1.2.2 LF-EMF對玉米淀粉結(jié)構(gòu)的影響 以蒸餾水代替反應(yīng)體系的α-淀粉酶,在LF-EMF輻射下分別處理12、24 h,5000 r/min離心5 min,沉淀于60 ℃烘箱中烘干。將LF-EMF輻射處理淀粉與原淀粉制成電鏡觀察樣品,采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)對樣品表面形態(tài)進(jìn)行對比分析;采用X射線衍射儀對樣品進(jìn)行XRD表征,CuKa射線,Ni濾波,管電壓40 kV,管電流15 mA,掃描速率8(°)/min,掃描范圍4～60 °;參照陳翠蘭等[14]的方法計算樣品的相對結(jié)晶度,對比結(jié)晶度變化。

1.2.3 LF-EMF處理對α-淀粉酶結(jié)構(gòu)的影響 為了研究LF-EMF輻射是否對酶結(jié)構(gòu)造成影響,對α-淀粉酶進(jìn)行LF-EMF處理后,進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)、圓二色譜(circular dichroism,CD)及熒光光譜分析。

1.2.3.1 LF-EMF對α-淀粉酶一級結(jié)構(gòu)的影響 將LF-EMF輻射處理的α-淀粉酶液與原酶液稀釋至相同濃度(0.15 mg/mL),通過SDS-PAGE電泳[15]分析,分離膠濃度為12%(分離范圍12～150 kDa),濃縮膠濃度為5%,上樣量為10 μL,預(yù)電泳電壓80 V,進(jìn)入分離膠后調(diào)到120 V,用0.25%的考馬斯亮藍(lán)R 250染色1 h,脫色過夜。電泳結(jié)果采用凝膠成像儀進(jìn)行拍照和分析。

1.2.3.2 LF-EMF對α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的影響 用pH6.4,5 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制0.4 mg/mLα-淀粉酶溶液,分別進(jìn)行LF-EMF輻射處理與非LF-EMF輻射處理對照,在處理時間為6、12、24 h時分別取樣0.5 mL,參考文獻(xiàn)[16]運(yùn)用圓二色譜儀檢測α-淀粉酶的CD圖譜。利用CDpro軟件計算α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲所占比例。

1.2.3.3 LF-EMF對α-淀粉酶三級結(jié)構(gòu)的影響 用pH6.4,50 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制0.008 mg/mLα-淀粉酶溶液。分別進(jìn)行LF-EMF輻射處理與非LF-EMF輻射處理對照,在處理時間為6、12、24 h時分別取樣1 mL,參照文獻(xiàn)[17]記錄激發(fā)波長為278 nm和發(fā)射波長298～436 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜。

1.2.4 LF-EMF下不同離子強(qiáng)度對α-淀粉酶催化效率的影響 電磁場可改變帶電粒子的運(yùn)動狀態(tài),提高動能[18],因此,反應(yīng)體系中的離子強(qiáng)度可能對LF-EMF作用于酶促反應(yīng)產(chǎn)生影響。為此,本文通過調(diào)整反應(yīng)體系的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液濃度[19-20],使反應(yīng)體系離子強(qiáng)度分別設(shè)置為0.0047、0.0237、0.0474、0.0947、0.1894、0.2841、0.4735 mol/L,其他反應(yīng)條件同1.2.1(每個實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)三個平行),進(jìn)行酶促淀粉水解反應(yīng)。反應(yīng)4 h后取樣檢測葡萄糖濃度,分析不同離子強(qiáng)度下LF-EMF對α-淀粉酶催化玉米淀粉水解效率的影響差異。

1.2.5 LF-EMF對傳質(zhì)的影響 參考文獻(xiàn)[21-22]以氯化鈉在溶液中的擴(kuò)散為模型進(jìn)一步探究LF-EMF對傳質(zhì)的影響。準(zhǔn)確稱量10 g NaCl固體于稱量瓶(?40 mm×25 mm)內(nèi),以飽和食鹽水裝滿,使之呈過飽和狀態(tài),用12000 kDa透析膜封口,將稱量瓶輕柔置于裝有500 mL蒸餾水的500 mL燒杯中。隨機(jī)分成兩組(每組3個平行),一組處于LF-EMF持續(xù)輻射,另一組為自然狀態(tài)的自由擴(kuò)散,每隔0.5 h用電導(dǎo)率儀檢測液面以下1 cm電導(dǎo)率值,分析LF-EMF輻射對離子擴(kuò)散的影響。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù),采用Excel 2010進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計,采用Origin(Pro 9.0)軟件對實(shí)驗(yàn)參數(shù)和結(jié)果進(jìn)行擬合分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LF-EMF對α-淀粉酶催化效率的影響

如圖1所示,在反應(yīng)時間內(nèi),LF-EMF輻射顯著提高α-淀粉酶催化玉米淀粉水解的反應(yīng)效率(p<0.05)。當(dāng)反應(yīng)時間為10 h時,LF-EMF輻射條件下淀粉水解產(chǎn)葡萄糖為14.39 mg/mL,比對照提高了15.90%。說明LF-EMF輻射提高了α-淀粉酶催化玉米淀粉水解的效率。

圖1 LF-EMF對α-淀粉酶水解玉米淀粉反應(yīng)的影響

2.2 LF-EMF對玉米淀粉結(jié)構(gòu)的影響

由圖2、圖3所示:電鏡圖顯示玉米淀粉經(jīng)LF-EMF輻射處理12、24 h后,表面光滑、平整、結(jié)構(gòu)緊密并未發(fā)生破裂,與原玉米淀粉對比無明顯差別。XRD分析顯示LF-EMF輻射處理的玉米淀粉與原淀粉在衍射圖譜上無明顯區(qū)別;經(jīng)計算,LF-EMF輻射處理12、24 h玉米淀粉與原淀粉的結(jié)晶度分別為26.92%、26.57%及26.74%,結(jié)晶度無顯著變化(p>0.05)。該結(jié)果表明LF-EMF輻射對玉米淀粉的形貌及晶體結(jié)構(gòu)均無顯著影響,說明LF-EMF輻射對酶促水解的促進(jìn)作用并非改變底物淀粉形貌或結(jié)構(gòu)所致。

圖2 玉米淀粉的電鏡圖(500×)

圖3 玉米淀粉的XRD圖

2.3 LF-EMF對α-淀粉酶結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 LF-EMF對α-淀粉酶一級結(jié)構(gòu)的影響 如圖4所示:經(jīng)LF-EMF輻射處理12 h及24 h后,α-淀粉酶在SDS-PAGE均顯示只有一條蛋白帶,其位置與原α-淀粉酶一致,分子質(zhì)量約為60 kDa,表明經(jīng)LF-EMF處理后,α-淀粉酶的肽鏈并未發(fā)生降解或聚合,α-淀粉酶的一級結(jié)構(gòu)并沒有受到顯著影響[23]。LF-EMF輻射對提高α-淀粉酶水解玉米淀粉的促進(jìn)作用并非由于改變催化劑α-淀粉酶的一級結(jié)構(gòu)所致。

圖4 α-淀粉酶SDS-PAGE電泳分析

2.3.2 LF-EMF對α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的影響 圓二色光譜(CD)是研究溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種重要手段,具有不同二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生CD譜帶的位置及吸收的強(qiáng)弱都不相同[23]。對比分析了經(jīng)LF-EMF處理的α-淀粉酶及對照酶的CD光譜圖,結(jié)果如圖5所示?？梢?經(jīng)LF-EMF處理6、12、24 h的α-淀粉酶CD光譜圖均未見特殊吸收峰出現(xiàn),與未進(jìn)行LF-EMF處理的對照酶譜圖的基本一致。利用CDpro軟件計算α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲所占比例見表1,計算結(jié)果顯示α-淀粉酶的主要二級構(gòu)象為β-折疊和無規(guī)則卷曲,占比均在30%以上,經(jīng)LF-EMF處理的α-淀粉酶及對照酶的四種二級構(gòu)象均無顯著變化(p>0.05)。

圖5 α-淀粉酶的CD光譜圖

表1 α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)含量

2.3.3 LF-EMF對α-淀粉酶三級結(jié)構(gòu)的影響 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以熒光光度儀分析了LF-EMF對α-淀粉酶結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果見圖6。α-淀粉酶的最大發(fā)射波長為340 nm,經(jīng)LF-EMF處理6、12、24 h后的α-淀粉酶其最大發(fā)射波長均未發(fā)生移位,表明酶蛋白熒光發(fā)色基團(tuán)周圍的微環(huán)境沒有發(fā)生改變;與對照相比,經(jīng)LF-EMF處理6、12、24 h的α-淀粉酶在熒光發(fā)射峰的峰高與峰形上均未見顯著改變(p>0.05)。

圖6 α-淀粉酶的熒光譜圖

上述LF-EMF輻射處理未發(fā)現(xiàn)對α-淀粉酶分子的圓二色光譜及熒光光譜造成影響有兩種可能性。一是在實(shí)驗(yàn)輻射強(qiáng)度及處理時間內(nèi),LF-EMF輻射確實(shí)不能影響或破壞酶分子上的氫鍵等次級鍵,不會對酶分子的高級構(gòu)象產(chǎn)生影響,LF-EMF輻射對提高α-淀粉酶水解玉米淀粉的促進(jìn)作用并非由于改變催化劑α-淀粉酶的分子構(gòu)象所致。第二種可能是:LF-EMF輻射會一定程度對影響α-淀粉酶的高級構(gòu)象,但其作用相對較弱,一旦脫離輻射區(qū),酶分子將迅速恢復(fù)其天然構(gòu)象,表現(xiàn)為圓二色光譜及熒光光譜檢測時未出現(xiàn)變化。此時,不能排除LF-EMF輻射對提高α-淀粉酶水解玉米淀粉的促進(jìn)作用為改變α-淀粉酶的分子構(gòu)象所致的可能性。

2.4 LF-EMF下不同離子強(qiáng)度對α-淀粉酶催化效率的影響

為進(jìn)一步探討LF-EMF輻射對促進(jìn)α-淀粉酶水解玉米淀粉的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)分析了LF-EMF輻射下不同離子強(qiáng)度對α-淀粉酶的催化效率,結(jié)果見圖7?？梢?在離子強(qiáng)度0.0047～0.4735 mol/L范圍內(nèi),離子強(qiáng)度對α-淀粉酶催化淀粉水解反應(yīng)具有相似的趨勢:在離子強(qiáng)度達(dá)到0.0947 mol/L前,提高反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度對酶促反應(yīng)具有促進(jìn)作用,高于離子強(qiáng)度為0.0947 mol/L則對酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用,張春玲等[24]關(guān)于大麥發(fā)芽過程中金屬離子對大麥酶系中淀粉酶活力影響的研究也報道相似的結(jié)果。但是,LF-EMF輻射下不同離子強(qiáng)度對α-淀粉酶催化效率的影響與對照實(shí)驗(yàn)具有顯著差異(p<0.05),主要表現(xiàn)在一下三個方面。第一,LF-EMF條件降低了α-淀粉酶最適離子強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)條件下,非LF-EMF輻射下最適離子強(qiáng)度為0.0947 mol/L,LF-EMF輻射使之降至0.0474 mol/L。第二,在低離子強(qiáng)度條件下,LF-EMF輻射對離子提高酶活的影響具有強(qiáng)化作用。其中,反應(yīng)體系離子強(qiáng)度由0.0047 mol/L提高至0.0237 mol/L時,非LF-EMF輻射下,反應(yīng)體系葡萄糖濃度由(4.90±0.05) mg/mL提高至(4.99±0.06) mg/mL,α-淀粉酶的催化效率提高了1.84%;LF-EMF輻射下反應(yīng)體系葡萄糖濃度則由(4.91±0.06) mg/mL提高至(5.29±0.02) mg/mL,催化效率提高了7.74%。第三,LF-EMF條件降低了高離子強(qiáng)度對α-淀粉酶的抑制作用。將反應(yīng)體系離子強(qiáng)度由0.0947 mol/L提高至0.2841 mol/L時,非LF-EMF輻射下,反應(yīng)體系葡萄糖濃度由(5.31±0.06) mg/mL降至(5.02±0.004) mg/mL,α-淀粉酶的催化效率降低了5.46%;LF-EMF輻射條件下反應(yīng)體系葡萄糖濃度則由(5.45±0.03) mg/mL降至(5.42±0.009) mg/mL,催化效率僅降低了0.55%。

圖7 LF-EMF下不同離子強(qiáng)度對α-淀粉酶催化效率的影響

離子對淀粉酶活性的影響機(jī)理很復(fù)雜,一般認(rèn)為,無機(jī)離子是通過改變酶蛋白的構(gòu)象來影響酶的活性的[25-27]。由于離子以強(qiáng)帶電顆粒形式存在,其在反應(yīng)體系中的運(yùn)動或與酶蛋白相互作用將受到LF-EMF輻射直接影響。推測在低濃度離子下,提高離子強(qiáng)度有利于改善淀粉酶催化構(gòu)象的形成,該作用在LF-EMF輻射作用下被進(jìn)一步強(qiáng)化,表現(xiàn)為最適離子強(qiáng)度的降低及對酶催化活性的促進(jìn)作用。在高離子強(qiáng)度下,此時無機(jī)離子濃度已經(jīng)滿足酶蛋白最適構(gòu)型所需,過高的離子濃度反而會對酶活性中心產(chǎn)生遮蔽或阻礙作用,造成對酶催化的抑制作用[28]。在LF-EMF輻射條件下,無機(jī)離子運(yùn)動被加強(qiáng),其對酶活性中心的遮蔽或阻礙作用被減弱,表現(xiàn)為降低高離子強(qiáng)度對α-淀粉酶的抑制作用。

2.5 LF-EMF對傳質(zhì)的影響

實(shí)驗(yàn)以溶液中NaCl擴(kuò)散為模型,探討了LF-EMF對溶液中物質(zhì)傳質(zhì)的影響。如圖8所示:隨NaCl的擴(kuò)散,溶液電導(dǎo)率呈線性上升,LF-EMF輻射處理及對照的電導(dǎo)率時間曲線斜率分別為121.75及98.78,表明LF-EMF輻射處理強(qiáng)化了溶液中離子的擴(kuò)散,增強(qiáng)因子β=1.23(斜率比)。武宏等[29]曾報道電磁場能夠加速質(zhì)量傳遞和擴(kuò)散速率,改善動力學(xué)條件,肖祖峰等[10]認(rèn)為電磁場可以降低傳質(zhì)過程中的活化能,強(qiáng)化傳質(zhì)。

圖8 溶液的時間電導(dǎo)率曲線

圖9 表觀膜厚度分析圖

3 結(jié)論

LF-EMF輻射可提高α-淀粉酶催化玉米淀粉水解的反應(yīng)效率,在反應(yīng)時間為10 h時,反應(yīng)效率提高15.90%。LF-EMF對玉米淀粉的形貌及結(jié)晶度沒有影響,也未引起α-淀粉酶的一級的變化,因此LF-EMF輻射對提高α-淀粉酶水解玉米淀粉的促進(jìn)作用并非由于改變底物結(jié)構(gòu)或改變催化劑一級結(jié)構(gòu)所致。實(shí)驗(yàn)雖未直接檢測出LF-EMF輻射對α-淀粉酶圓二色光譜及熒光光譜的影響,但LF-EMF輻射降低了α-淀粉酶最適離子強(qiáng)度,強(qiáng)化了低離子強(qiáng)度條件下無機(jī)離子對酶活的促進(jìn)作用,降低了高離子強(qiáng)度對α-淀粉酶的抑制作用等結(jié)果,均表明不能排除LF-EMF輻射影響α-淀粉酶高級構(gòu)象,進(jìn)而提高酶促反應(yīng)效率的可能性。LF-EMF輻射可促進(jìn)反應(yīng)過程傳質(zhì),是提高α-淀粉酶酶促反應(yīng)效率的原因之一。在后續(xù)工作中,需要進(jìn)一步研究LF-EMF輻射促進(jìn)酶催化淀粉水解的反應(yīng)機(jī)理,特別是在應(yīng)用更有效的技術(shù)手段分析LF-EMF輻射對酶高級構(gòu)象的可能影響,以及LF-EMF輻射對α-淀粉酶在淀粉粒表面吸附作用的影響等方面進(jìn)行深入的研究。