ELISA與NAT檢測(cè)在血液HBV篩查中的關(guān)系研究

錢江 蔡雋 華重千 牛鴻婧

全球每年有近百萬人因輸入不健康血液或血液制品而感染病毒性肝炎等輸血傳播性疾病，已約有4億人感染了慢性乙型肝炎，HBV感染已成為世界性的公共衛(wèi)生問題[1]。國(guó)人HBsAg陽(yáng)性率約為9.8%，HBV感染率約為59.3%，超過1.3億人為HBV攜帶者，約8億多人感染了HBV[2]。人體感染HBV后容易引發(fā)肝炎、肝硬化，甚至發(fā)展成肝癌，嚴(yán)重威脅生命安全。為降低輸血傳播HBV的發(fā)生率，采供血機(jī)構(gòu)常采用2種不同廠家生產(chǎn)的ELISA試劑對(duì)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行HBsAg檢測(cè)。但由于HBV檢測(cè)窗口期長(zhǎng)、臨床變異株多以及免疫沉默現(xiàn)象等的局限，ELISA檢測(cè)仍然存在一定程度的漏檢。病毒核酸擴(kuò)增（NAT）技術(shù)基于直接檢測(cè)HBV核酸的原理，在人體感染HBV后數(shù)天內(nèi)就能檢出血液標(biāo)本中極其微量的病毒DNA，可大幅縮短病毒檢測(cè)窗口期[3-4]，降低HBV漏檢的發(fā)生率。基于此，本研究通過分析ELISA與NAT檢測(cè)血液HBV的符合率，探討這2種方法在血液HBV篩查中的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 血液標(biāo)本 選取金華市中心血站2017年6月至2018年6月經(jīng)采血現(xiàn)場(chǎng)快速初篩合格的獻(xiàn)血者血液標(biāo)本共59 483份，所有獻(xiàn)血者均符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》的規(guī)定。按照《血站技術(shù)操作規(guī)程2015》的要求，在采血結(jié)束后立即依次用3支采血管留取相應(yīng)血液標(biāo)本，第1支為帶分離膠的促凝管（EDTA－K2促凝、5ml）用于血清學(xué)檢測(cè)；第2支為帶分離膠的的真空采血管（EDTA－K2抗凝、8ml）用于核酸檢測(cè)；第3支為無分離膠的抗凝管（EDTA-K2抗凝、5ml）用于血型、ALT的檢測(cè)。血液采集后4h內(nèi)離心分離紅細(xì)胞和血漿，置于2～8℃環(huán)境保存，72h內(nèi)完成血液核酸檢測(cè)。

1.2 試劑 HBsAg ELISA檢測(cè)國(guó)產(chǎn)試劑（廈門新創(chuàng)，批號(hào)：2107015103、2017045109等），進(jìn)口試劑（法國(guó)伯樂，批號(hào)：6M0223、7A0226等）。HBV DNA NAT檢測(cè)試劑（美國(guó)羅氏 Cobas TaqScreen MPX 2.0 test，批號(hào)：215559、235646等）。

1.3 儀器設(shè)備 Xantus150全自動(dòng)酶免加樣儀（深圳愛康公司），F(xiàn)ame24/20全自動(dòng)酶免分析儀（瑞士HAMILTON公司），Microlab Star全自動(dòng)混樣儀（瑞士HAMILTON公司），COBAS@AmpliPrep全自動(dòng)核酸提取純化儀（美國(guó)羅氏公司），COBAS@TaqMan全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（美國(guó)羅氏公司）。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 ELISA檢測(cè) 采用Xantus150全自動(dòng)酶免加樣儀將血液標(biāo)本分配至各檢測(cè)項(xiàng)目的微板上，用Fame24/20全自動(dòng)酶免分析儀對(duì)其進(jìn)行加酶、孵育、洗板、顯色，用血站實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)判讀結(jié)果。2種ELISA試劑檢測(cè)HBsAg結(jié)果均呈反應(yīng)性則判為雙試劑陽(yáng)性；2種試劑檢測(cè)結(jié)果均呈無反應(yīng)性則判為陰性；單試劑初篩結(jié)果呈反應(yīng)性，雙孔復(fù)檢后結(jié)果呈反應(yīng)性則判為單試劑陽(yáng)性，否則為陰性。ELISA檢測(cè)陽(yáng)性包括ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性與單試劑陽(yáng)性。

1.4.2 NAT檢測(cè) 先采用Microlab Star全自動(dòng)混樣儀對(duì)ELISA檢測(cè)陰性和單試劑陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行6人份HBV DNA的混樣檢測(cè)，再用COBAS@AmpliPrep全自動(dòng)核酸提取純化儀對(duì)混樣樣本進(jìn)行核酸的提取和純化，最后用COBAS@TaqMan全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)檢測(cè)HBV DNA擴(kuò)增后的靶序列，在PDM服務(wù)器中自動(dòng)判讀結(jié)果。混樣檢測(cè)結(jié)果呈無反應(yīng)性則判定為6個(gè)標(biāo)本HBV DNA檢測(cè)陰性。混樣檢測(cè)結(jié)果呈反應(yīng)性則進(jìn)行拆分檢測(cè)，拆分檢測(cè)呈無反應(yīng)性則判定HBV DNA檢測(cè)陰性；若拆分檢測(cè)結(jié)果呈反應(yīng)性則判定該標(biāo)本HBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性。ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本直接進(jìn)行單人份HBV DNA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果呈無反應(yīng)性則判定HBV DNA檢測(cè)陰性，檢測(cè)結(jié)果呈反應(yīng)性則判定HBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性。

1.5 觀察指標(biāo) （1）ELISA與NAT檢測(cè)血液HBV的結(jié)果；（2）ELISA 與 NAT 檢測(cè)血液 HBV 的符合率；（3）ELISA與NAT檢測(cè)血液HBV的標(biāo)本吸光度與臨界值的比值（S/CO值）分布情況，S/CO值反映出NAT檢測(cè)對(duì)不同濃度HBV DNA的檢測(cè)能力。

2 結(jié)果

2.1 ELISA與NAT檢測(cè)血液HBV結(jié)果59 483例血液標(biāo)本中ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本25例，ELISA檢測(cè)單試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本30例，ELISA檢測(cè)陰性NAT檢測(cè)陽(yáng)性120例，ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陰性的標(biāo)本6例，ELISA檢測(cè)單試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陰性的標(biāo)本38例，ELISA與NAT檢測(cè)陰性的標(biāo)本59 264例，見表1。

表1 59483例血液標(biāo)本ELISA與NAT檢測(cè)HBV結(jié)果[例（%）]

2.2 ELISA與NAT檢測(cè)血液HBV的符合率 ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本31例，其中NAT檢測(cè)陽(yáng)性25例，兩者符合率為80.6%；ELISA檢測(cè)單試劑陽(yáng)性68例，其中NAT檢測(cè)陽(yáng)性30例，兩者符合率為44.1%；ELISA檢測(cè)陽(yáng)性共99例，其中NAT檢測(cè)陽(yáng)性共55例，ELISA與NAT檢測(cè)血液HBV的符合率為55.5%。

2.3 ELISA與NAT檢測(cè)血液HBV的S/CO值分布情況 ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本共25例，其中S/CO值＜2為1例，2≤S/CO值＜5為1例，S/CO值≥5為23例；ELISA檢測(cè)單試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本共30例，其中S/CO值＜2為14例，2≤S/CO值＜5為11例，S/CO值≥5為5例；ELISA檢測(cè)單試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陰性標(biāo)本共38例，其中S/CO值＜2為24例，2≤S/CO值＜5為11例，S/CO值≥5為3例；見表2。

表2 ELISA與NAT檢測(cè)血液HBV的S/CO值分布情況[例（%）]

3 討論

輸血作為一種重要的治療方法已廣泛應(yīng)用于臨床，但輸血也存在傳播各類病毒的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)患者造成嚴(yán)重的危害，因此輸血安全問題已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著ELISA檢測(cè)試劑靈敏度、特異度的大幅提升，輸血傳播性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)已大幅降低，但由于存在檢測(cè)窗口期，ELISA檢測(cè)無法從根本上杜絕其發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過90%HBV、HIV和75%以上的HCV的輸血傳播感染均來源于病毒窗口期，NAT檢測(cè)可直接檢測(cè)病毒微量核酸，將窗口期分別從原來的50、72、22d縮短至25、59、11d[5]，是一種理想的檢測(cè)技術(shù)。

本研究通過對(duì)金華市中心血站59 483例血清標(biāo)本進(jìn)行ELISA與NAT檢測(cè)HBV，檢出ELISA檢測(cè)陽(yáng)性NAT檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本55例，ELISA檢測(cè)陽(yáng)性NAT檢測(cè)陰性標(biāo)本44例，因未進(jìn)行追蹤確認(rèn)，無法判斷是NAT漏檢或是ELISA檢測(cè)假陽(yáng)性，也無法對(duì)其真實(shí)的血清學(xué)狀態(tài)進(jìn)行判斷。分析造成ELISA檢測(cè)陽(yáng)性NAT檢測(cè)陰性的原因，可能是由于獻(xiàn)血者體內(nèi)攜帶HBV，因處于血清學(xué)轉(zhuǎn)換期，HBV載量過低，NAT無法直接檢測(cè)到病毒DNA，但可以通過ELISA檢測(cè)到HBsAg，故ELISA檢測(cè)對(duì)處于血清轉(zhuǎn)換期的HBV攜帶者具有較好的排查作用。ELISA檢測(cè)陰性NAT檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本高達(dá)120例，通過NAT檢測(cè)彌補(bǔ)ELISA不能直接檢測(cè)病毒核酸的方法學(xué)缺陷，可有效避免攜帶HBV的血液制品用于臨床。有研究報(bào)道稱，若采用國(guó)產(chǎn)ELISA試劑與NAT聯(lián)檢，獻(xiàn)血人群中HBV漏檢率約為16/10萬；若采用進(jìn)口ELISA試劑與NAT聯(lián)檢，獻(xiàn)血人群中HBV漏檢率約為1.6/10萬[6]。國(guó)產(chǎn)試劑的ELISA漏檢率比進(jìn)口試劑大10倍，進(jìn)口ELISA試劑的檢測(cè)靈敏度明顯優(yōu)于國(guó)產(chǎn)試劑，因此血站檢驗(yàn)科可以選擇或保持進(jìn)口ELISA試劑與NAT聯(lián)檢的方式對(duì)獻(xiàn)血者血清標(biāo)本進(jìn)行血液HBV篩查，以提高準(zhǔn)確度。

本研究ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陽(yáng)性25例，ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陰性6例，兩者符合率為80.6%，這與張瓊等[7]報(bào)道相似，NAT有部分漏檢的情況也基本與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相符[8-11]。ELISA檢測(cè)單試劑陽(yáng)性68例，其中NAT檢測(cè)陽(yáng)性30例，兩者符合率僅為44.1%，明顯低于ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性NAT陽(yáng)性的符合率。由于ELISA檢測(cè)各環(huán)節(jié)中的不可控因素較多，單試劑檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本中會(huì)存在高比例的假陽(yáng)性[12]，是導(dǎo)致符合率較低的原因之一。觀察S/CO值分布情況可知，ELISA檢測(cè)雙試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本中S/CO值≥5比例為92.0%；而ELISA檢測(cè)單試劑陽(yáng)性NAT檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本中S/CO值≥5比例僅為16.6%，NAT對(duì)不同載量乙肝病毒檢測(cè)能力的差異造成了兩者符合率的不同。

NAT檢測(cè)是以HBV DNA為檢測(cè)對(duì)象，可以大大縮短抗體檢測(cè)窗口期。目前，很多未開展NAT檢測(cè)的血站仍然采用ELISA檢測(cè)方法對(duì)HBsAg進(jìn)行檢測(cè)，由于HBV病毒載量低，這樣做容易使處于血清轉(zhuǎn)換期的HBV漏檢，NAT檢測(cè)技術(shù)正好彌補(bǔ)了這一缺陷[13-14]，可降低隱匿性乙型肝炎的發(fā)生率。在HBV疫苗接種、抗病毒藥物使用、抗病毒治療的過程中，由于病毒變異，HBsAg的合成降低、結(jié)構(gòu)改變，病毒復(fù)制受限，均會(huì)造成HBV在ELISA檢測(cè)中漏檢，而NAT檢測(cè)則不受此類因素的制約。

綜上所述，ELISA與NAT檢測(cè)在血液HBV篩查中各具優(yōu)勢(shì)、各有利弊，2種檢測(cè)方法不能相互取代，只能互為補(bǔ)充。本血站現(xiàn)行的ELISA與NAT相結(jié)合的檢測(cè)模式是目前采供血機(jī)構(gòu)降低HBV輸血傳播發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比較理想的一種檢測(cè)模式，對(duì)保障血液安全起著重要的作用。