臺灣相思假芝根腐病病原菌的鑒定及其生物學(xué)特性測定

吳如慧 李增平 程樂樂 張宇

摘 ?要 ?對海南臺灣相思上一種假芝屬真菌所致根腐病病原菌進(jìn)行致病性測定、形態(tài)學(xué)特征鑒定和SSU序列分析，確認(rèn)引起海南臺灣相思此種根腐病的病原菌為假芝[Amauroderma?rugosum （Bl.et Nees） Torrend]。生物學(xué)特性測定結(jié)果表明：光照可以促進(jìn)其菌絲生長，菌絲最適生長溫度為32?℃，最適pH為5，D-果糖和酵母浸膏為最佳碳源和氮源。

關(guān)鍵詞 ?海南;臺灣相思;根腐病;假芝;生物學(xué)特性

中圖分類號 ?S763.7 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Abstract ?Based on the pathogenicity determination， identification of morphological characteristics and SSU sequence analysis， the pathogen causing Amauroderma root rot of Acacia confusa was identified as Amauroderma?rugosum （Bl.et Nees） Torrend. Biological characteristics tests showed that the optimum growth conditions were 32?℃， pH 5， continuous illumination， D-fructose as the carbon source， and yeast extract as the nitrogen source.

Keywords ?Hainan; Acacia confusa; root rot; Amauroderma?rugosum （Bl.et Nees） Torrend; biological characters

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.020

臺灣相思（Acacia confusa Merr.）屬于金合歡屬含羞草科，是一種原產(chǎn)于中國臺灣南部的常綠喬木，其生長迅速，耐干旱，有根瘤，具有固氮作用，可改良土壤， 對提升土壤肥力有著很好的作用，且具有木材用途廣等特性，適用于荒山造林、是沿海防護(hù)林的先鋒樹種[1-3]。相思樹樹冠蒼翠濃綠，抗風(fēng)性強(qiáng)，是行道樹、遮蔭樹、園景樹、護(hù)坡樹、防風(fēng)樹的優(yōu)良樹種，而且維護(hù)成本低。近年來，隨著造林面積的不斷擴(kuò)大，筆者調(diào)查中發(fā)現(xiàn)相思樹上發(fā)生的病害不斷加重，其中根腐病最為嚴(yán)重。筆者在對海南省各市縣的相思樹林地進(jìn)行病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，一些整株發(fā)病枯死或接近死亡的臺灣相思樹其莖干基部和近地表的根系上長出假芝屬的擔(dān)子果，病根木質(zhì)部組織呈現(xiàn)黃白色濕腐，將此病害取名為假芝根腐病。

假芝屬（Amauroderma）由美國真菌學(xué)家William Alphonso Mur rill于1905年建立， 指定模式種為Amauroderma schomburgkii =Fomes regulicolor[4]。假芝屬真菌主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國華南和西南的部分地區(qū)分布較多。我國假芝屬的分類學(xué)研究始于鄧叔群先生，共記錄了我國假芝屬的10個種和1個變型。1980年以來，趙繼鼎等對我國的假芝屬作了大量的工作，他們一系列研究報道了產(chǎn)于我國的二孢假芝（A. subresinosum）、廈門假芝（A. amoiense）、耳匙假芝（A. auriscalpium）、華南假芝（A. austrosinense）等22個種[5-7]，秦改娟等也報道了我國的1個新記錄種（A. subrugosum）[8]。戴玉成等報道曾在海南五指山市等地方有大量的臺灣相思樹死亡，詳細(xì)調(diào)查后發(fā)現(xiàn)其病原菌為熱帶靈芝 [Ganoderma tropicum （Jungh.） Bres.]和粗柄假芝（A. elmerianum Murrill.）[9]，譚象生等也報道熱帶靈芝可以導(dǎo)致臺灣相思樹根部腐爛[10]。但未見有假芝屬真菌引起活立木根腐病的致病性及生物學(xué)特性等的進(jìn)一步研究。因此，本研究從海南省定安、臨高、澄邁、儋州等地的發(fā)病臺灣相思病株上取樣，對其病原菌的致病性、種類鑒定及生物學(xué)特性等進(jìn)行深入研究，旨在進(jìn)一步明確該病害的假芝屬真菌種類，為摸清其發(fā)生流行規(guī)律及綜合防治提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試樣本及接種苗木 ?2015—2017年從海南省定安縣南麗湖南海農(nóng)場、臨高、澄邁、儋州等地發(fā)病的臺灣相思（A. confusa Merr.）病株的根莖部采集新鮮擔(dān)子果樣本10份，樣品均用保鮮袋包裝后帶回實驗室備用。致病性測定所用耳葉相思（A. auriculiformis A. Cunn. ex Benth.）、馬占相思（A. mangium Willd.）及臺灣相思（A. confuse Merr.）幼苗由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院提供。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基和查彼（Czapek）培養(yǎng)基，具體配制方法參閱《植病研究方法》[11]配制，木屑培養(yǎng)基參考高秀兵等[12]方法配制。

1.1.3 ?試劑及儀器 ?E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit、Omega Gel Extraction Kit、2×Taq-Mixture、DNA Marker 2000，美國Omega Bio-Tek公司。Olympus BX 51 顯微鏡。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌株分離培養(yǎng) ?利用常規(guī)組織分離法，從采集的新鮮擔(dān)子果上分離菌株，先用70%的酒精對擔(dān)子果表面消毒，再用滅完菌的手術(shù)刀把擔(dān)子果邊緣表皮削除，用滅菌的鑷子夾取帶菌管處的菌肉接種到PDA 上，28?℃恒溫培養(yǎng)，分離菌株純化后轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基作為菌種保存?zhèn)溆?，編號為HNDA005。

1.2.2 ?接種體的制備 ?在純化后的HNDA005菌株菌落邊緣挑取邊長1?cm的正方形大小菌絲塊放置于已滅菌的袋裝木屑培養(yǎng)基中制備接種體，放置到28?℃培養(yǎng)箱進(jìn)行恒溫黑暗培養(yǎng)15～20 d，直至菌絲布滿整個培養(yǎng)基。用放置空白瓊脂塊的木屑培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.3 ?菌株的致病性測定 ?先在待接種植株臺灣相思樹、耳葉相思和馬占相思樹的莖干表面噴70%酒精進(jìn)行表面消毒，再用滅菌手術(shù)刀對待接種植株進(jìn)行輕微創(chuàng)傷，將布滿HNDA005菌株菌絲的接種體緊緊貼在切口處，并用濕棉花進(jìn)行保濕，最后用保鮮膜纏繞固定。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，對照株用同樣的方法接空白木屑培養(yǎng)基。接種后每隔10?d對苗木長勢和侵染情況進(jìn)行觀察，并進(jìn)行拍照記錄。接種方法參照高秀兵等[12]方法，略作改動。

1.2.4 ?擔(dān)子果誘導(dǎo) ?挑取純化后的邊長1?cm的正方形菌株菌絲塊放置于已滅菌的瓶裝木屑培養(yǎng)基中進(jìn)行擔(dān)子果誘導(dǎo)，放置到室內(nèi)對其進(jìn)行保濕，定時觀察。

1.2.5 ?菌株的鑒定 ?形態(tài)鑒定：選擇有代表性的10個擔(dān)子果，根據(jù)《中國真菌志》[7]、《中國大型真菌》[13]和《中國熱帶真菌》[14]等資料對病原菌的擔(dān)子果進(jìn)行宏觀特征與顯微結(jié)構(gòu)的描述與鑒定。觀察菌落形態(tài)，并在光學(xué)顯微鏡下對病菌的顯微結(jié)構(gòu)觀察、測量并拍照。

分子鑒定：將菌株培養(yǎng)7?d后用液氮研磨收集的100 mg菌絲，使用OMEGA Fungal DNA Kit來提取DNA。采用通用引物 NS1（5′-GTAGT CATATGCTTGTCTC-3′）和NS4（5′-CTTCCGTCA ATTCCTTTAAG-3′）[15]擴(kuò)增核糖體小亞基基因序列，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。擴(kuò)增產(chǎn)物在恒壓150 V下用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用OMEGA Gel Extraction Kit試劑盒切膠回收目的片段，純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序獲得的SSU序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，并提交序列。利用 MEGA 6.0軟件以鄰接法（neighbor-joining，NJ），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.2.6 ?生物學(xué)特性測定 ?菌株HNDA005培養(yǎng)6 d后用直徑5 mm 的打孔器對其菌落邊緣打取菌餅，并將菌餅接種各供試培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，十字交叉法測量菌落直徑。各培養(yǎng)基設(shè)置3個重復(fù)。除碳、氮源生物學(xué)測定外，其他條件所使用的培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基。

溫度：將菌柄接種PDA培養(yǎng)基后置于10、15、20、25、28、30、32、35、40?℃共9個溫度梯度下恒溫黑暗培養(yǎng)。

光照：測定條件設(shè)置為完全黑暗、日光燈連續(xù)照射、12 h光暗交替3種條件，28?℃恒溫培養(yǎng)。

pH：在已滅菌的PDA培養(yǎng)基凝固之前，用 1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將pH分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11共10個梯度，28?℃恒溫培養(yǎng)。

碳、氮源：分別稱取等質(zhì)量的葡萄糖、麥芽糖、D-果糖、蔗糖、可溶性淀粉、肌醇、D-山梨醇作為碳源;稱取等質(zhì)量的酵母浸膏、大豆蛋白胨、牛肉膏、L-天冬酰胺、草酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈣、硝酸鈉、硝酸鉀作為氮源;分別替換Czapek培養(yǎng)基中的碳、氮源，設(shè)三組重復(fù)接菌餅進(jìn)行測定。將不加蔗糖、硝酸鈉的Czapek培養(yǎng)基作為缺碳、缺氮空白對照。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件和SAS 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Duncans multiple range test進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?臺灣相思假芝根腐病癥狀

發(fā)病的臺灣相思樹最初的表現(xiàn)為葉片失綠、發(fā)黃，繼而枯黃脫落，樹冠變稀疏，生長不良、枯枝多、重病株全株干枯死亡，病株易被強(qiáng)風(fēng)連根吹倒。病根表面變黑，木質(zhì)部組織呈黃白色海綿狀濕腐，在發(fā)病植株的莖干基部、近地面的病根上長出新鮮的灰褐色或灰黑色擔(dān)子果，擔(dān)子果下表面灰白色，用手指按壓或受其他機(jī)械傷后很快變?yōu)檠t色（圖1）。

2.2 ?致病性測定

3個月后檢查接種了HNDA005菌株的臺灣相思樹受侵染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種后的臺灣相思樹葉子枯黃，樹冠稀疏;4個月后整株枯死，接種菌從接種部位侵入木質(zhì)部并擴(kuò)展，接種點處的莖干組織變黑褐色，周圍組織白腐，與田間發(fā)病癥狀相同，對照組創(chuàng)傷后的傷口已愈合，植株無明顯變化。采發(fā)病組織進(jìn)行分離獲得相同的菌株，表明分離菌為致病菌。馬占相思和耳葉相思樹致病性測定結(jié)果同上。

2.4 ?病原菌的鑒定

2.4.1 ?形態(tài)特征 ?菌落生長特性：病原菌HNDA005菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落初期呈白色，菌絲較濃密，平伏生長，邊緣近圓形，隨后菌絲從中間向邊緣逐漸變淡褐色到深褐色。3個月后菌落邊緣有褐色釘狀凸起的幼小擔(dān)子果長出，培養(yǎng)基顏色呈深褐色（圖4A，圖4B）。在木屑培養(yǎng)基上接種一個月后，接種體內(nèi)布滿褐色致密菌絲，5個月后長出與樹上相同表面黃褐色的擔(dān)子果（圖3）。

擔(dān)子果：擔(dān)子果1年生，有柄，木栓質(zhì)。菌蓋腎形、半圓形或圓形，新鮮時軟木栓質(zhì)，干燥后變硬為木質(zhì)，質(zhì)量明顯變輕，大小為（4.8～8.5）cm× （4.8～10.0）cm，厚0.3～1.2 cm。菌蓋上表面灰褐色、污褐色、暗褐色至黑褐色或黑色，無光澤，干燥后呈黑褐色，有顯著的同心環(huán)帶和放射狀皺紋，被青灰色微絨毛，無漆樣光澤;邊緣鈍或呈截形，有時薄，波浪狀，稍內(nèi)卷。菌肉呈淡褐色或較深的灰色，有時呈污白色，但比菌管色淡，厚1.5～9.6 mm;菌管暗褐色至深褐色，長1.8～5.2 mm;擔(dān)子果下表面新鮮時呈灰白色，觸摸受傷后迅速變?yōu)檠t色，最后變?yōu)楹诤稚蚝谏?管口近圓形或稍不規(guī)則形，每毫米4～6個;菌柄側(cè)生、中生或偏生，圓柱形，與菌蓋同色，有時分叉，近光滑或有細(xì)微絨毛，長5～10 cm，直徑0.28～1.5 cm，有假根，有時分叉（圖4C～圖4F）。

顯微結(jié)構(gòu)：皮殼構(gòu)造由交錯的薄壁菌絲構(gòu)成，淡褐色。菌絲系統(tǒng)三體型：生殖菌絲透明、薄壁，波浪狀，直徑為2.914～4.128 μm;骨架菌絲微帶淡黃褐色，厚壁到實心，骨架干直徑為3.562～5.121 μm，呈樹狀分支，分支末端形成鞭毛狀無色纏繞菌絲;纏繞菌絲無色，厚壁，有分枝，直徑1.285～2.610 μm（圖4G）。擔(dān)孢子近球形，雙層壁，外壁無色透明，平滑，內(nèi)壁淡黃褐色或近無色，有微小刺或小刺不清楚，大小為8.486～10.601（9.691）μm× 7.178～8.627（8.195）μm（圖4H）。

2.4.2 ?rDNA-SSU序列比對 ?測序后獲得HNDA005菌株的rDNA-SSU序列為534 bp，NCBI在線Blastn比對所得SSU序列（NCBI登錄號為MH543323）與NCBI登錄號為HM480839.1等的假芝（Amauroderma?rugosum）序列的相似度最高，達(dá)98%。將HNDA005菌株SSU序列與GenBank中已有的SSU基因序列進(jìn)行同源性比較，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析同源關(guān)系。結(jié)果顯示，HNDA005菌株的rDNA-SSU序列與假芝的同源性最高，表明該病原菌HNDA005與假芝遺傳距離最小，聚為一類（圖4）。結(jié)合形態(tài)

A：病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長6 d的菌落;B：病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長90 d后長出的幼嫩擔(dān)子果;C、D、E：新鮮的擔(dān)子果;F：干燥的擔(dān)子果;G：菌絲（①骨架菌絲;②纏繞菌絲;③生殖菌絲）;H：擔(dān)孢子。

2.5 ?生物學(xué)特性

2.5.1 ?溫度對假芝菌絲生長的影響 ?不同溫度對菌株菌落生長的影響差異顯著。當(dāng)溫度在 15～40?℃之間，病原菌HNDA005菌株菌絲均能生長，適宜生長溫度為25～35?℃，最適生長溫度為32?℃， 到10?℃時停止生長，但是并未死亡，轉(zhuǎn)移至適宜溫度時可繼續(xù)生長（圖6）。

不同小寫字母表示0.05水平上的差異顯著，不同大寫字母表示0.01水平上的差異極顯著。

2.5.2 ?光照對假芝菌絲生長的影響 ?在不同光照條件處理下，病原菌HNDA005菌株菌絲生長速度差異較小，在連續(xù)光照條件下菌絲生長速度最快，菌落邊緣整齊，菌絲中間褐色邊緣白色，致密，生長均勻，在完全黑暗條件下生長最慢（圖7）。

2.5.3 ?pH對假芝菌絲生長的影響 ?不同pH條件對菌株菌落生長的影響差異顯著。病原菌HNDA005菌株的菌絲在pH 2時生長緩慢，pH 3～4時菌絲生長速率增快，pH 5時菌落直徑極顯著高于其他處理，表明pH 5最適宜菌絲生長（圖8），表明該病原菌在弱酸性環(huán)境中生長要比在堿性環(huán)境中好。

2.5.4 ?碳、氮源對假芝菌絲生長的影響 ?供試的8種碳源培養(yǎng)基均能夠顯著促進(jìn)病原菌HNDA005菌株菌絲生長，其中在以D-果糖為碳源的菌落直徑最大，且其菌絲致密，菌落近圓形，長勢優(yōu)良;其次為可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖上菌落較大，長勢一般;在肌醇和D-山梨醇中菌落直徑最小，不同小寫字母表示0.05水平上的差異顯著，不同大寫字母表示0.01水平上的差異極顯著。不同小寫字母表示0.05水平上的差異顯著，不同大寫字母表示0.01水平上的差異極顯著且菌落稀薄，碳源的利用率低。表明該病菌菌絲對不同的碳源或者不同種類的同類型碳源的利用率存在差異（表1）。

供試的12種氮源培養(yǎng)基對病原菌 HNDA005 菌株菌絲生長的影響存在一定的差異，單一氮源以硝酸鈣為氮源的菌落直徑最大，其次為硝酸銨。草酸銨為氮源的菌落直徑最小。在缺氮元素的培養(yǎng)基中，菌絲稀薄。復(fù)合氮源中酵母浸膏菌落直徑最大，菌落圓形，致密。表明病原菌對不同的氮源利用率存在差異（表2）。

3 ?討論

假芝（A. rugosum）屬于靈芝科（Ganoder- mataceae）假芝屬（Amauroderma），主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，我國華南及西南地區(qū)。人們對假芝屬真菌的研究歷史悠久，除了藥用價值外，對引起林木病害的研究報道較少。其中大多數(shù)生長在倒木和腐朽木上，是腐生菌，但也有一些種類寄生在活立木上，如二孢假芝[Amauroderma subresinosum （Murrill） Corner]等是林木的病原菌。戴玉成等人報道海南五指山市等地臺灣相思樹死亡的病原菌中有粗柄假芝（Amaurode rma elmerianum Murrill.）[9]。本文作者在海南省定安市南麗湖南海農(nóng)場等地發(fā)現(xiàn)的臺灣相思根腐病病樹上的假芝屬擔(dān)子菌經(jīng)形態(tài)學(xué)特征比較并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定分析，確定該病菌為假芝[Amauro derma rugosum （Bl.et Nees） Torrend]，兩者擔(dān)子果形態(tài)上較相似，但假芝的管口近圓形或不規(guī)則形，擔(dān)孢子近球形，而粗柄假芝的管口近圓形，擔(dān)孢子廣橢圓形[14]。該病原菌在三種光照條件下沒有明顯差別，黑暗對其生長存在抑制作用;適宜生長溫度范圍為25～35?℃，最適生長溫度為32?℃;最適pH為5;在測定的幾種碳源中，以D-果糖為碳源的菌落長勢最好;在氮源方面，單一氮源以硝酸鈣為氮源的菌落長勢最好。在復(fù)合氮源中，酵母浸膏為氮源長勢最好。肖自添等[17]在廣州市白云山得到的一株假芝最適碳源是果糖與作者研究基本一致;最適pH生長范圍是7.0～8.0，比筆者研究的pH 5偏堿;最適生長溫度范圍是30?℃，與筆者研究基本一致。

雖然許多真菌學(xué)家都曾從不同角度對假芝屬成員進(jìn)行過研究[18-19]，但總體說來，目前國內(nèi)外關(guān)于假芝屬的研究資料主要集中于分類學(xué)特性部分[4-7]. 目前尚未見對臺灣相思莖腐病病原菌假芝[Amauroderma?rugosum （Bl.et Nees） Torrend]生物學(xué)特性等內(nèi)容的研究。本次研究為有效防治臺灣相思樹木腐菌害提供理論依據(jù)。

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