黃芪甲苷抑制IKK/NF-κB炎癥通路減輕高糖誘導的H9c2心肌細胞損傷*

張書春 ，代紫陽 ，王 亞 ，夏 娟 ，杜夢凡 ，姚 紋

（1.唐山南湖醫(yī)院，唐山 063000；2.華北理工大學中醫(yī)學院，唐山 063210）

糖尿病是一種多病因引起的以高血糖為特征的內分泌代謝性疾病。高血糖還可通過誘導、加重炎癥反應、氧化應激等機制在糖尿病諸多并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中占重要地位。糖尿病性心肌病是一種常見的糖尿病心血管并發(fā)癥，是獨立于高血壓性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的心肌損害性疾病。研究顯示炎癥反應在糖尿病心肌損害的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的作用[1]。其中，在糖尿病心肌損傷相關動物、細胞模型中存在大量炎癥細胞因子如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌及炎癥相關信號分子如核轉錄因子-κB（NF-κB）等的過度激活，持續(xù)存在的炎癥反應最終導致心肌損害的發(fā)生[2-4]。黃芪甲苷是中藥黃芪所含有的重要有效化學成分之一，具有明確的降糖、調脂作用[5]，且通過抗氧化應激、抗炎、抗細胞凋亡等機制對心血管系統(tǒng)具有廣泛的保護作用[6]。本研究旨在觀察黃芪甲苷對高糖誘導H9c2心肌細胞損傷的保護作用，并從 IκB 激酶（IKK）/NF-κB 炎癥相關通路探討其作用機制。

1 材料與儀器

1.1 細胞株 大鼠胚胎心臟組織來源的H9c2細胞株，購自中科院上海細胞庫。

1.2 實驗用藥 黃芪甲苷購自遼寧生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 試劑 DMEM高糖、低糖培養(yǎng)基（GIBCO公司），胰蛋白酶（SIGMA公司），胎牛血清（GIBCO公司），噻唑藍（MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所），TNF-α、IL-6（南京建成生物工程研究所），兔抗大鼠IKK-β、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）、TNF-α（Cell Signaling 公司），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.4 儀器 37℃二氧化碳孵箱，上海易亮醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺，江蘇蘇州凈化設備公司；冷凍離心機，德國SIGMR Laborzentrifugen；酶標儀，奧地利TECAN公司；JY200C電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；半干轉運系統(tǒng)，BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 37℃、5%CO2條件下孵育H9c2細胞，給予 10%FBSDMEM（低糖，5.5 mmol/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長融合約覆蓋皿底面積80%時進行傳代。無血清低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，使各組細胞生長同步化后再進行下一步實驗。

2.2 MTT法檢測細胞活性 細胞貼壁生長48 h，吸棄每孔原培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基100μL，再加入MTT溶液10μL，置細胞于培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育4 h。每孔加入DMSO 150μL，于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育細胞15 min，使用酶標儀測定吸光度OD值（波長570 nm）。

2.3 高糖誘導心肌細胞損傷模型的建立 根據(jù)文獻研究[7]及預實驗的實驗結果，以高糖（33.3 mmol/L）培養(yǎng)基處理H9c2心肌細胞24 h建立心肌細胞損傷模型。

2.4 黃芪甲苷對細胞活力的影響 選擇對數(shù)生長期H9c2心肌細胞，胰酶消化后重懸細胞，進行細胞計數(shù)，以2 000個細胞/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板。黃芪甲苷（20、40、80μmol/L）預處理 6 h，再加入高糖培養(yǎng)基24 h，MTT法檢測細胞活性。

2.5 分組及處理 正常對照組：給予10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖對照組：給予10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖+黃芪甲苷低劑量組：黃芪甲苷（20μmol/L）預處理6 h，再給予10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖+黃芪甲苷中劑量組：黃芪甲苷（40μmol/L）預處理6 h，再給予10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖+黃芪甲苷高劑量組：黃芪甲苷（80μmol/L）預處理6 h，再給予10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測 TNF-α和IL-6的含量待細胞生長融合約覆蓋皿底面積80%時，按照分組給予不同處理后，收集培養(yǎng)基作待測標本，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，測定出細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的含量水平。實驗重復5次。

2.7 Western Blot檢測 IKK、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）、TNF-α水平吸棄各組細胞培養(yǎng)液上清，加入IP細胞裂解液冰上裂解30 min，刮取細胞，離心 15 min（4℃，12 000 r/min）。BCA 法測定細胞蛋白濃度。制備分離膠（10%）和濃縮膠（5%）。上樣總蛋白100μg，加入電泳緩沖液，設定電泳電壓及時間（濃縮膠∶80 V，40 min；分離膠∶150 V，1 h）。再將蛋白轉移至PVDF膜上（52 mA，2 h）。5%脫脂奶粉封閉1 h， 加 入 相 應 一 抗 （IKK、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）、TNF-α、GAPDH），4℃過夜。洗膜后孵育HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠第二抗體，室溫2 h。再次洗膜后，ECL顯色，暗室內曝光。結果用Image J軟件分析，計算蛋白條帶灰度值，目的蛋白表達水平用目的蛋白與內參蛋白的灰度比值來表示。

2.8 數(shù)據(jù)處理 應用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，實驗所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者選用LSD法，方差不齊者選用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度黃芪甲苷對各組細胞存活率的影響 與正常對照組相比，高糖對照組的細胞存活率明顯下降（P＜0.05）；與高糖對照組相比，高糖+黃芪甲苷（20、40、80μmol/L）各組的細胞存活率有所提高，且黃芪甲苷對細胞存活率的提高效果呈劑量依賴性。在黃芪甲苷藥物治療組中，高糖+黃芪甲苷高劑量組（80μmol/L）組的細胞存活率最高（P＜0.05）。見表1。

表1 不同處理因素對高糖誘導的心肌細胞存活率的影響（x±s）Tab.1 Effects of different treatment factors on the survival rate of myocardial cells induced by high glucose（x±s）

3.2 各組細胞培養(yǎng)液上清TNF-α和IL-6的含量 與正常對照組相比，高糖對照組細胞培養(yǎng)液上清中TNF-α和IL-6的含量均明顯增加（P＜0.05）；與高糖對照組相比，高糖+黃芪甲苷（20、40、80 μmol/L）各組的TNF-α和IL-6在細胞培養(yǎng)液上清中的含量均有所降低（P＜0.05），且降低效果呈黃芪甲苷劑量依賴性，以高糖+黃芪甲苷高劑量組（80μmol/L）下降最為顯著（P＜0.05）。見表 2。

表2 各組心肌細胞培養(yǎng)液上清TNF-α和IL-6的含量（x±s）Tab.2 Supernatant contents of TNF-αand IL-6 in each group（x±s）ng/L

3.3 黃芪甲苷對H9c2細胞IKK-β，NF-κB，p-NF-κB，TNF-α蛋白表達的影響 與正常對照組比較，高糖對照組H9c2細胞IKK-β蛋白表達增加顯著（P＜0.05），NF-κB 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），但NF-κB 磷酸化水平顯著增加（P＜0.05），TNF-α 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。黃芪甲苷各處理組H9c2細胞 IKK-β 蛋白表達下降（P＜0.05），NF-κB 磷酸化水平減弱（P＜0.05），TNF-α蛋白表達明顯降低（P＜0.05），且各指標變化呈現(xiàn)黃芪甲苷劑量依賴性，以黃芪甲苷高劑量組改變最為明顯（P＜0.05）。見表 3、圖 1。

表3 黃芪甲苷對H9c2細胞IKK-β，NF-κB，p-NF-κB，TNF-α 蛋白表達的影響（x±s）Tab.3 Effect of astragaloside IV on protein expressions of IKK-β，NF-κB，p-NF-κB and TNF-α in H9c2 cells（x±s）%

圖1 黃芪甲苷對H9c2細胞IKK-β，NF-κB，p-NF-κB，TNF-α蛋白表達的影響Fig.1 Effect of astragaloside IV on protein expressions of IKK-β，NF-κB，p-NF-κB and TNF-α in H9c2 cells

4 討論

糖尿病性心肌病是一種發(fā)生于糖尿病患者的特異性心肌病變，可造成糖尿病患者心力衰竭，具有較高的死亡率。糖尿病以慢性高血糖為特征，高糖刺激與炎癥狀態(tài)密切相關[8]，而炎癥是糖尿病心肌損害的發(fā)生機制之一，亦有諸多研究表明抗炎可以有效減輕糖尿病心肌損害[9-10]。其中，TNF-α可引發(fā)炎癥和細胞損傷，最終導致心肌纖維化[11]。在糖尿病心肌病大鼠模型中，抑制TNF-α可以減少心肌纖維化，改善心臟功能[12]。本實驗高糖孵育H9c2心肌細胞24 h建立細胞損傷模型，細胞活力明顯下降，細胞培養(yǎng)液上清中的炎癥因子如TNF-α、IL-6水平明顯升高，細胞內TNF-α的蛋白表達亦增高，提示高糖誘導的心肌細胞損傷與炎癥反應密切相關。

NF-κB是廣泛存在于機體內的核轉錄因子，是介導炎癥因子釋放的關鍵性轉錄因子[13]。當細胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB與抑制性蛋白IκB以復合體的形式存在，處于未激活、無活性狀態(tài)；當細胞受到多種因素刺激后，IκB激酶復合體（IKK）中的催化亞基IKK-β將IκB磷酸化并使之降解，從而NF-κB被磷酸化激活。磷酸活化的NF-κB轉移至細胞核內，與特定靶基因結合并調控靶基因轉錄，釋放IL-6、TNF-α等相關炎癥因子[14]。而TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放可反饋性作用于NF-κB，使之處于持續(xù)激活狀態(tài)，進而持續(xù)的炎癥狀態(tài)造成心肌損傷[15]。本實驗高糖誘導的心肌細胞損傷模型中IKK-β蛋白表達增加，NF-κB磷酸活化水平加強，提示IKK/NF-κB炎癥相關通路過度激活。

黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，其降糖、治療糖尿病并發(fā)癥的藥理作用明確[16-17]。黃芪甲苷可增強心肌收縮力，改善心肌能量代謝，抑制心室肥厚、心肌纖維化及心肌細胞凋亡，保護血管內皮細胞，降血壓，對心血管系統(tǒng)具有廣泛的保護作用[18-20]。然而糖尿病心肌損害的發(fā)病機制十分復雜[21]，黃芪甲苷究竟是通過哪些路徑來保護心肌細胞避免其受高血糖損害還需進一步探索。本實驗結果顯示，給予H9c2心肌細胞黃芪甲苷預處理6 h可以明顯增強高糖孵育條件下的心肌細胞活力，降低細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6水平，減弱細胞內TNF-α的蛋白表達，并明顯抑制過度激活的IKK/NF-κB炎癥相關通路。

綜上所述，高糖刺激誘導IKK/NF-κB炎癥通路的級聯(lián)反應過度激活參與糖尿病心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展過程。黃芪甲苷呈劑量依賴性對糖尿病心肌損害具有明顯的防治作用，各項異常指標的改善情況以黃芪甲苷高劑量組（80μmol/L）最為顯著，其可能機制是與降低IKKβ的蛋白表達，下調NF-κB的磷酸活化水平，從而抑制了IKK/NF-κB炎癥通路的過度激活，繼而降低了TNF-α、IL-6相關炎癥因子水平有關。