丹參酮分別聯(lián)合伊曲康唑、特比萘芬對(duì)紅色毛癬菌體外抗菌活性研究Δ

王 丹，于淑萍，吳景良，齊?；?，段昕所

(1.無錫市第三人民醫(yī)院整形美容科，江蘇 無錫 214000； 2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚性病科，河北 承德 067000)

真菌性皮膚病是由皮膚癬菌感染，其中紅色毛癬菌是常見皮膚癬菌。近年來，紅色毛癬菌病的發(fā)病率逐年升高，因其治愈效果較差，病死率也呈不斷升高趨勢(shì)；由于紅色毛癬菌隱藏較為隱蔽，所致疾病的病程較長(zhǎng)，不僅難以治愈，還容易反復(fù)發(fā)作及再感染，若未及時(shí)救治，甚至可引發(fā)丹毒、淋巴管炎及感染中毒性休克等并發(fā)癥，降低患者生活質(zhì)量[1]。目前，臨床主要采用丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬等抗真菌藥治療紅色毛癬菌感染，但不同藥物對(duì)紅色毛癬菌的敏感性存在差異性。同時(shí)，因臨床用藥時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致耐藥菌株顯著增加，故多應(yīng)用聯(lián)合治療以減少耐藥性，提高治療效果[2-3]?；诖耍狙芯渴占t色毛癬菌并應(yīng)用丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)，觀察丹參酮對(duì)紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響，以期為臨床治療提供可靠實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取臨床分離紅色毛癬菌40株進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)，菌株來自體股癬、甲真菌病，經(jīng)常規(guī)組織分離并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。男性患者17例，女性患者23例；年齡4～65歲，平均(45.32±5.94)歲；直接鏡檢：陽性20例，陰性20例；部位：趾甲28例，指甲8例，其他部位4例；耐35 ℃高溫試驗(yàn)：耐高溫24株，不耐高溫16株；色素試驗(yàn)：產(chǎn)紅色素23株，未產(chǎn)色素17株。

1.2 方法

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(clinical and laboratory standards institute，CLSI)M38-A2方案，檢測(cè)丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對(duì)紅色毛癬菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，并采用分級(jí)抑制濃度指數(shù)(factional inhibitory concentration index，F(xiàn)IC)評(píng)價(jià)丹參酮聯(lián)合伊曲康唑、特比萘芬效果。

1.3 藥品配制

丹參酮(美國(guó)Acros Organics公司，純度99%)，終質(zhì)量濃度為0.250 0～128.000 0 μg/ml。伊曲康唑(比利時(shí)楊森制藥公司，批號(hào)：7073402)，終質(zhì)量濃度為0.031 2～16.000 0 μg/ml。特比萘芬(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100563-200301)，終質(zhì)量濃度為0.031 2～16.000 0 μg/ml。采用沙氏葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基倍比稀釋，將其倍比稀釋為由高至低8個(gè)濃度的含藥培養(yǎng)液備用。

1.4 菌懸液的制備

紅色毛癬菌于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行活化并純化，并加入無菌0.85%氯化鈉溶液l ml制備菌懸液，后使用巴氏吸管將菌懸液置入無菌試管中，加入1粒無菌玻璃珠在振蕩器上振蕩2 min，靜置后取上部勻質(zhì)液體再次振蕩15 s。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用RPMI 1640液調(diào)節(jié)菌懸液濃度為(2～6)×105CFU/ml備用。再使用RPMI 1640液稀釋50倍進(jìn)行接種，菌懸液最終濃度為(2～6)×103CFU/ml。

1.5 試驗(yàn)過程

1.5.1 丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬單獨(dú)藥物敏感試驗(yàn)：通過移液器提取丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬的倍比稀釋液100 μl，依次加入96孔板第1—10列孔，加入2倍終濃度菌懸液100 μl，第11列孔加入2倍終濃度菌懸液100 μl、RPMI 1640液體培養(yǎng)基100 μl作為陽性對(duì)照，第12列孔加入RPMI 1640液體培養(yǎng)基200 μl、不加菌懸液為陰性對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5～7 d后待陽性對(duì)照生長(zhǎng)良好(肉眼檢查出現(xiàn)80%以上生長(zhǎng)抑制)進(jìn)行MIC結(jié)果判定。

1.5.2 丹參酮聯(lián)合伊曲康唑、特比萘芬的藥物敏感試驗(yàn)：采用棋盤微量稀釋法，使用微量移液器將藥物加入96孔板第1—10列孔，按照從高到低濃度依次加入丹參酮倍比稀釋藥液各50 μl和伊曲康唑、特比萘芬倍比稀釋液各50 μl，再加入2倍終濃度菌懸液100 μl，第11列孔加入RPMI 1640液體培養(yǎng)基100 μl、2倍終濃度菌懸液100 μl；第12列孔加入RPMI 1640液體培養(yǎng)基200 μl。28 ℃恒溫培養(yǎng)，5～7 d后進(jìn)行FIC結(jié)果判定，其中FIC<1為協(xié)同作用，1≤FIC<2為無關(guān)作用，F(xiàn)IC≥2為拮抗作用。

1.6 質(zhì)量控制

每株菌株均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，并進(jìn)行質(zhì)控、參考菌株檢測(cè)，質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC6258。結(jié)果均由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師共同判讀，意見不一致時(shí)可共同討論決定。

1.7 紅色毛癬菌電鏡標(biāo)本制備

2倍終濃度菌懸液100 μl分別由高濃度到低濃度加入96孔板第1—10列孔中，第11列孔僅加紅色毛癬菌菌懸液為生長(zhǎng)對(duì)照，第11、12列孔紅色毛癬菌菌懸液與藥物均不加為空白對(duì)照。將上述菌懸液100 μl分別加入各孔內(nèi)，并將菌懸液與抗真菌藥物(丹參酮和伊曲康唑、特比萘芬的倍比稀釋液)分別以1∶1稀釋至終濃度。于26 ℃環(huán)境下孵育，7 d進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋即染色等，制備成電鏡樣品，另選取正常紅色毛癬菌作為對(duì)照，采用掃描電鏡與透射電鏡觀察紅色毛癬菌菌絲外觀形態(tài)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁及細(xì)胞核等超微結(jié)構(gòu)變化情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單獨(dú)抗真菌藥物的MIC比較采用多樣本比較的Kruskal-wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用秩轉(zhuǎn)換后單因素方差分析，丹參酮聯(lián)合伊曲康唑、特比萘芬抗菌FIC采用精確概率法χ2檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對(duì)紅色毛癬菌的MIC比較

丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對(duì)紅色毛癬菌MIC的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中伊曲康唑MIC較低，丹參酮MIC較高，見表1。

2.2 丹參酮聯(lián)合不同質(zhì)量濃度伊曲康唑的FIC比較

丹參酮僅聯(lián)合0.031 2、0.062 5 μg/ml的伊曲康唑時(shí)，F(xiàn)IC<1所占比例分別為42.50%(17/40)、45.00%(18/40)，以協(xié)同作用為主；而聯(lián)合其他質(zhì)量濃度的伊曲康唑時(shí)以拮抗作用為主，不同質(zhì)量濃度組間比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對(duì)紅色毛癬菌MIC結(jié)果 比較(n=40)Tab 1 Comparison of MIC results among tanshinone, itraconazole and terbinafine against trichophyton rubrum (n=40)

表2 丹參酮聯(lián)合不同質(zhì)量濃度伊曲康唑的FIC比較(n=40)Tab 2 Comparison of FIC results among tanshinone combined with different concentrations of itraconazole (n=40)

2.3 丹參酮聯(lián)合不同質(zhì)量濃度特比萘芬的FIC比較

丹參酮聯(lián)合不同質(zhì)量濃度的特比萘芬時(shí)均以拮抗作用為主，不同質(zhì)量濃度組間比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 丹參酮聯(lián)合不同質(zhì)量濃度特比萘芬的FIC比較(n=40)Tab 3 Comparison of FIC results among tanshinone combined with different concentrations of terbinafine (n=40)

2.4 丹參酮對(duì)紅色毛癬菌掃描電鏡及透射電鏡結(jié)果

掃描電鏡下觀察，正常紅色毛癬菌菌絲細(xì)胞壁完整，質(zhì)地致密，細(xì)胞基質(zhì)均勻，可見細(xì)胞核、線粒體等超微結(jié)構(gòu)，見圖1。掃描電鏡下觀察，250 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌72 h后，菌絲形態(tài)發(fā)生明顯改變，表面變粗糙，現(xiàn)破壞性裂縫，并出現(xiàn)多處斷裂，見圖2。掃描電鏡下觀察，62.5 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌72 h后，菌絲形態(tài)未發(fā)生明顯變化，僅見較小破壞性孔洞，且菌絲粗細(xì)均勻，見圖3。透射電鏡下觀察，250 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌72 h后，細(xì)胞變形明顯，細(xì)胞壁粗糙，厚薄不均，細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞核破碎，改變紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)，見圖4。

圖1 正常紅色毛癬菌的掃描電鏡圖Fig 1 Scanning electron microscopy of normal trichophyton rubrum

圖2 250 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌的掃描電鏡圖Fig 2 Scanning electron microscope of 250 μg/ml of tanshinone acts on trichophyton rubrum

圖3 62.5 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌的掃描電鏡圖Fig 3 Scanning electron microscope of 62.5 μg/ml of tanshinone acts on trichophyton rubrum

圖4 250 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌的透射電鏡圖Fig 4 Transmission electron microscopy of 250 μg/ml of tanshinone acts on trichophyton rubrum

3 討論

臨床將真菌性皮膚病分為淺部真菌病及深部真菌病，紅色毛癬菌作為淺部真菌病主要致病菌，可引發(fā)手足癬、頭癬及甲癬等，臨床多表現(xiàn)為不同程度瘙癢、疼痛及功能性障礙等癥狀，而紅色毛癬菌發(fā)病與菌株類型、免疫因素等存在密切聯(lián)系[4-6]。隨著臨床對(duì)真菌感染研究的不斷深入，抗真菌藥的發(fā)展取得卓越成就，并具有良好的治療效果，但因其廣泛應(yīng)用，真菌耐藥現(xiàn)象也日益增多，引發(fā)多種不良反應(yīng)，患者依從性較差[7-8]。因此，選取高效、廣譜且低毒的抗真菌藥成為治療紅色毛癬菌病的關(guān)鍵。

丹參為臨床治療常用中草藥，其中丹參酮為主要有效成分之一，并包括丹參酮 Ⅰ、丹參酮 ⅡA及異丹參酮等十余種單體，具有清除氧自由基、抑制炎癥細(xì)胞增殖、殺傷腫瘤細(xì)胞及抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等作用[9-10]。臨床研究結(jié)果顯示，丹參酮對(duì)銅綠假單胞菌具有較強(qiáng)體外抑菌作用；而對(duì)紅色毛癬菌進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥可發(fā)揮各種藥物的不同作用機(jī)制，具有較強(qiáng)協(xié)同作用[11-12]。但目前關(guān)于丹參酮用于紅色毛癬菌的臨床研究較少，也未能明確單一用藥或聯(lián)合抗真菌藥的效果；其中伊曲康唑、特比萘芬是治療真菌感染常用的系統(tǒng)性抗真菌藥，經(jīng)證實(shí)兩者對(duì)紅色毛癬菌所致肉芽腫可發(fā)揮良好治療作用[13-14]。故本研究探討了丹參酮聯(lián)合伊曲康唑、特比萘芬的抑菌作用，從而為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

因影響MIC測(cè)定的因素較多，當(dāng)前皮膚癬菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，本研究參照的M38-A2方案(CLSI制定)經(jīng)胡小平等[15]研究結(jié)果證明其重復(fù)性及穩(wěn)定性較好，可指導(dǎo)用藥并監(jiān)控耐藥菌株發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對(duì)紅色毛癬菌MIC的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中伊曲康唑MIC較低，丹參酮MIC較高。表明丹參酮對(duì)紅色毛癬菌的抗菌作用較弱，需聯(lián)合其他有效抗真菌藥提高治療效果。丹參酮僅聯(lián)合0.031 2、0.062 5 μg/ml的伊曲康唑時(shí)，F(xiàn)IC<1所占比例分別為42.50%(17/40)、45.00%(18/40)，以協(xié)同作用為主；而聯(lián)合其他質(zhì)量濃度的伊曲康唑時(shí)以拮抗作用為主，不同質(zhì)量濃度組間比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丹參酮聯(lián)合不同質(zhì)量濃度的特比萘芬時(shí)均以拮抗作用為主，不同質(zhì)量濃度組間比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示丹參酮聯(lián)合伊曲康唑、特比萘芬具有較強(qiáng)拮抗作用，在紅色毛癬菌病治療過程中不能在應(yīng)用丹參酮同時(shí)聯(lián)合伊曲康唑、特比萘芬治療，以減少不良反應(yīng)，避免抗菌藥物濫用。應(yīng)用電鏡觀察丹參酮對(duì)紅色毛癬菌形態(tài)學(xué)影響，研究結(jié)果顯示，250 μg/ml丹參酮對(duì)紅色毛癬菌具有較強(qiáng)破壞性，而62.5 μg/ml丹參酮對(duì)紅色毛癬菌破壞性明顯降低。提示丹參酮破壞紅色毛癬菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，胞內(nèi)細(xì)胞器受損更為嚴(yán)重，增加真菌通透性，從而發(fā)揮較強(qiáng)抗菌作用，且不同濃度的丹參酮對(duì)紅色毛癬菌作用效果存在差異性，對(duì)于其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，丹參酮對(duì)紅色毛癬菌具有一定抑制作用，隨著濃度增加而抑菌作用增強(qiáng)。丹參酮分別聯(lián)合伊曲康唑、特比萘芬對(duì)紅色毛癬菌均以拮抗作用為主，故應(yīng)避免聯(lián)合應(yīng)用。而丹參酮可使紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，進(jìn)而發(fā)揮有效抗真菌作用。本研究為臨床治療因紅色毛癬菌引起的真菌性皮膚病提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，但因所實(shí)施的體外藥物敏感試驗(yàn)是在參考CLSI M38-A2方案與相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行的，理論性較強(qiáng)，難以反映機(jī)體實(shí)際情況，結(jié)果存在不足，對(duì)此應(yīng)在大量樣本基礎(chǔ)上進(jìn)行多中心加強(qiáng)驗(yàn)證，為臨床治療紅色毛癬菌感染提供用藥參考。