鴨坦布蘇病毒的研究進(jìn)展

任斌斌 于可響 黃兵

摘? 要：鴨坦布蘇病毒病是由坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）引起的一種以產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量下降和雛鴨或育成鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為主要特征的傳染性疾病。2010年在我國(guó)江浙地區(qū)首先暴發(fā)，隨后迅速波全國(guó)主要養(yǎng)鴨省份，給我國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。本文主要從生物學(xué)特征、傳播途徑、流行病學(xué)、臨床癥狀、診斷等方面闡述該病毒的最新研究進(jìn)展，為其相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒;暴發(fā);研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.325.3? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2019）04-0055-05

自2010年4月以來(lái)，在我國(guó)主要養(yǎng)鴨地區(qū)，爆發(fā)了一種新型急性傳染病，該病傳播迅速，可造成產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量嚴(yán)重下降，肉鴨或育成鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀等。由于產(chǎn)蛋鴨感染后，其特征性病變主要表現(xiàn)為卵泡膜出血，該疾病最初被命名為鴨出血性卵巢炎（DHO）。進(jìn)一步研究證明，該病是由一種新型黃病毒——坦布蘇病毒（TMUV）引起的[1]。

1? 生物學(xué)特征

1.1? 分類(lèi)學(xué)地位? 2012年，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）公布的分類(lèi)結(jié)果表明，坦布蘇病毒歸屬于黃病毒科（Flaviviridae）、黃病毒屬（genus Flavivirus），是蚊媒病毒類(lèi)成員。黃病毒屬有病毒70余種，包含登革熱病毒（Dengue virus，DENV）、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、黃熱病毒（Yellow fever virus，YFV）、西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）等多種常見(jiàn)病毒[2]。

1.2? 形態(tài)結(jié)構(gòu)? 坦布蘇病毒粒子的大小直徑為40～50nm[3]，大小為10.9kb[4]。電鏡下呈小球形，為對(duì)稱(chēng)的十二面體，表面有鑲嵌糖蛋白的脂質(zhì)包膜，病毒包膜內(nèi)含有核衣殼蛋白，病毒核酸為單股正鏈RNA[5]。

1.3? 理化特性和培養(yǎng)特性? 坦布蘇病毒為有囊膜的單股RNA病毒，可被氯仿滅活，對(duì)去氧膽酸鈉敏感。在pH為1.0～5.0時(shí)不穩(wěn)定。該病毒不耐熱，56℃ 15min即可滅活，37℃放置48h病毒滴度由105.75 TCID50/0.2ml下降到102.25 TCID50/0.2ml，4℃放置48h后其TCID50略有下降。1.0mol/L MgCl2不能提高病毒在50℃的穩(wěn)定性[6]。此外，黃病毒大多能夠凝集鵝、鴿和新生雛雞的紅細(xì)胞，但其血凝素易于破壞，而且血凝反應(yīng)要求比較嚴(yán)格的pH域[7]。

鴨坦布蘇病毒易在9～11日齡的鴨胚、雞胚尿囊腔或尿囊膜上生長(zhǎng)，可以用鴨胚或SPF雞胚來(lái)進(jìn)行病毒的分離和增殖，胚的病變主要表現(xiàn)為：胚體出血、死亡，尿囊膜增厚，尿囊液減少[8]。鴨坦布蘇病毒可以在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）和鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）上增殖，適應(yīng)DEF后的病毒通常在36～48h產(chǎn)生CPE，隨時(shí)間延長(zhǎng)，CPE更加明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增強(qiáng)，細(xì)胞變圓以及細(xì)胞融合，最終崩解死亡[6]。

2? 流行病學(xué)

本病最初于2010年春季在我國(guó)江蘇、浙江等地流行，隨后迅速擴(kuò)散到我國(guó)主要的鴨養(yǎng)殖地區(qū)。我國(guó)華東（江蘇、浙江、上海、福建、安徽、山東、江西）、華中（河南、湖南、湖北）、華北（北京、河北）、華南（廣東、廣西）等省區(qū)鴨群均有TMUV感染的報(bào)道[9]。

大多數(shù)黃病毒屬的病毒能引起人獸共患疾病，并呈現(xiàn)不同的臨床癥狀，主要引起病毒性腦炎甚至全身性感染。節(jié)肢動(dòng)物是黃病毒屬病毒主要的宿主和傳播媒介，在自然條件下，節(jié)肢動(dòng)物的分布特點(diǎn)受地理環(huán)境與季節(jié)氣候的影響，故該類(lèi)病毒的致病性也具有明顯的地域性和季節(jié)性[10]。鴨坦布蘇病毒不僅能在不同品種鴨鵝中傳播流行，還可感染其它動(dòng)物，如豬、雞、麻雀等[11-12]。坦布蘇病毒可通過(guò)庫(kù)蚊傳播，鳥(niǎo)類(lèi)特別是家禽為其貯存宿主[13]。但鴨坦布蘇病毒的具體傳播媒介不明。該病在秋季流行嚴(yán)重，推測(cè)可能與蚊蟲(chóng)有關(guān)，但進(jìn)入蚊蟲(chóng)較少的冬季后，該病仍然在部分地區(qū)蔓延，因此，是否有其他的傳播途徑有待進(jìn)一步證實(shí)[14]。

3? 臨床癥狀及病理變化

產(chǎn)蛋鴨群多以產(chǎn)蛋下降為主，產(chǎn)蛋率從產(chǎn)蛋高峰（80%～90%）下降至10%以下，甚至絕產(chǎn)，蛋殼質(zhì)量變化不明顯，死淘率約1%，后期有繼發(fā)性細(xì)菌感染。少量鴨站立不穩(wěn)，頭頸抽搐、行走不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)，病鴨雙腿癱瘓，伴有呼吸系統(tǒng)疾病，側(cè)臥，發(fā)病鴨多排黃綠色糞便[15]。發(fā)病鴨各臟器均有不同程度病變，可見(jiàn)皮下、肌肉彌散性出血;心臟腫大、出血，心肌壞死;肝臟表面有點(diǎn)狀壞死灶，似水煮過(guò)，有塊狀出血片，并且呈土黃色;脾臟腫脹、出血、淤血，甚至破裂，呈斑駁樣大理石紋;肺臟腫大、腎臟腫大有壞死點(diǎn)，偶見(jiàn)出血點(diǎn);卵泡變性、卵泡膜出血。雛鴨腦部均出現(xiàn)不同程度水腫或呈樹(shù)枝狀充血[16]。

鴨感染坦布蘇病毒后的病理組織學(xué)變化主要表現(xiàn)為：肝實(shí)質(zhì)嚴(yán)重變性、壞死;肺淤血，內(nèi)有大量炎性細(xì)胞滲出;胰腺組織可見(jiàn)凝固性壞死灶;脾淋巴細(xì)胞局部減少;腎小管上皮細(xì)胞腫脹[17];腦部神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并有“衛(wèi)星現(xiàn)象”，腦部血管壁增厚，血管擴(kuò)張充血，大、小腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，局部發(fā)生軟化及壞死;肝臟有嚴(yán)重的脂肪變性，充滿(mǎn)膽色素，毛細(xì)血管擴(kuò)張[18]。

4? 診斷方法

4.1? 臨床診斷? 首先，根據(jù)鴨坦布蘇病毒病的臨床癥狀特點(diǎn)，產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量驟降，死淘率大約1%;排黃綠色糞便，并且出現(xiàn)少量鴨站立不穩(wěn)、頭頸抽搐、行走不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)癥狀，嚴(yán)重者病鴨雙腿癱瘓[15]。

其次，根據(jù)其病理變化的特點(diǎn)，各臟器均有不同程度病變，表現(xiàn)為心臟腫大、出血，心肌壞死;肝臟表面有點(diǎn)狀壞死灶，似水煮過(guò)，有塊狀出血片，并且呈土黃色;脾臟腫脹、出血、淤血，甚至破裂，呈斑駁樣大理石紋;肺臟腫大，腎臟腫大、有壞死點(diǎn)，偶見(jiàn)出血點(diǎn);卵泡變性、卵泡膜出血;腦部出現(xiàn)不同程度水腫或呈樹(shù)枝狀充血[15-16]。

根據(jù)以上的臨床癥狀和剖檢病理變化來(lái)初步懷疑是否是鴨坦布蘇病毒病，然后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷方法來(lái)確診。

4.2? 血清學(xué)診斷

4.2.1? 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)? 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法是在實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)中最常用的檢測(cè)方法之一，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高及檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的疾病診斷和疫苗效果的評(píng)價(jià)。

姬希文等[19]、張德寶[20]和陳偉國(guó)等[21]等研究利用純化的鴨坦布蘇病毒奉賢株（FX2010）作為包被抗原，建立了檢測(cè)DTMUV血清抗體的間接ELISA方法，并且對(duì)各種檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法具有較高的敏感性和特異性。施少華等研究了以純化的鴨坦布蘇病毒W(wǎng)R株為包被抗原，建立檢測(cè)鴨坦布蘇病毒卵黃抗體的間接ELISA方法[22]。萬(wàn)春和等對(duì)鴨坦布蘇病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因進(jìn)行原核表達(dá)，并進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定，并將表達(dá)成功具有生物學(xué)活性的重組蛋白經(jīng)純化后，作為抗原包被ELISA平板，通過(guò)條件優(yōu)化，建立檢測(cè)禽坦布蘇病毒血清學(xué)檢測(cè)方法[23]。李晨曦等利用DTMUV特異性抗原表位建立Epitopc-ELISA血清學(xué)診斷方法，并對(duì)126份鴨血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，以中和試驗(yàn)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示Epitopc-ELISA檢測(cè)方法的相對(duì)特異性為100%，相對(duì)敏感度為96%，并且Epitopc-ELISA與其他黃病毒血清間不出現(xiàn)交叉反應(yīng)性[24]。

4.2.2? 乳膠凝集試驗(yàn)? 乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）具有準(zhǔn)確靈敏、簡(jiǎn)便易行、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的血清學(xué)檢測(cè)。用于鴨坦布蘇病毒抗體的臨床檢測(cè)，不需要特殊設(shè)備，且可在1～5min內(nèi)肉眼觀(guān)察判定結(jié)果，臨床應(yīng)用簡(jiǎn)便快速[25]。

萬(wàn)春和等以經(jīng)超速和密度梯度離心濃縮純化的鴨坦布蘇病毒抗原進(jìn)行方陣滴定，篩選出致敏乳膠的最佳條件，并制備成鴨坦布蘇病毒乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）用抗原，與特異性的鴨坦布蘇病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒，進(jìn)而建立檢測(cè)鴨坦布蘇病毒抗體的乳膠凝集試驗(yàn)方法[25]。陳浩等用其實(shí)驗(yàn)室制備并純化的抗坦布蘇病毒 PrM 蛋白單克隆抗體致敏乳膠，采用方陣法，優(yōu)化乳膠凝集試驗(yàn)的最佳條件，建立坦布蘇病毒反向乳膠凝集試驗(yàn)并應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)[26]。

4.3? 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

4.3.1? RT-PCR檢測(cè)技術(shù)? 張帥等在對(duì) DTMUV序列的比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立了 DTMUV的一步法RT-PCR檢測(cè)方法。該方法具有特異、快速、敏感、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以檢出1.82個(gè)TCID50的病毒核酸[27]。傅光華等、祖立闖等和王永娟等根據(jù)連接酶依賴(lài)PCR工作原理設(shè)計(jì)并建立一種坦布蘇病毒RT-PCR快速檢測(cè)方法[28～30]。

4.3.2? 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)? 李慶陽(yáng)等根據(jù)鴨坦布蘇病毒BYD-1株基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立了快速檢測(cè) DTMUV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法[31]。萬(wàn)春和等根據(jù)鴨坦布蘇病毒NS5基因序列設(shè)計(jì)引物，建立基于SYBGreenⅠ檢測(cè)模式的實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR，該方法在2.74×103～2.74×107拷貝/μl反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系[32]。劉青濤等根據(jù)鴨坦布蘇病毒NS2A基因的保守序列，設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)特異性引物，建立了一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)方法[33]。

張艷芳等針對(duì)GenBank中DTMUV基因和鴨瘟病毒（DPV）UL6基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成了2對(duì)引物和2條TaqMan探針。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，建立了鑒別DTMUV和DPV的二重?zé)晒舛縍T-PCR方法[34]。孫敏華等參考GenBank上已發(fā)表的產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDSV）五鄰體基因序列、H9亞型禽流感病毒的HA基因和鴨坦布蘇病毒E基因序列，分別設(shè)計(jì)了檢測(cè)EDSV、H9 AIV和DTMUV的特異性引物，擴(kuò)增目的片段大小分別為110bp、281bp和266bp，通過(guò)PCR驗(yàn)證及引物濃度的優(yōu)化，建立了針對(duì)這3種病毒的三重?zé)晒?PCR檢測(cè)方法。該方法可以同時(shí)檢測(cè)EDSV、H9AIV和DTMUV，且不能檢出1型鴨甲肝病毒、3型鴨甲肝病毒、番鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鵝細(xì)小病毒、番鴨細(xì)小病毒、新城疫病毒和大腸桿菌基因組 DNA，敏感性試驗(yàn)表明，該方法對(duì)EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的檢測(cè)下限分別為8.0、4.8和1.3個(gè)拷貝，比常規(guī)PCR方法敏感10倍[35]。

4.3.3? 反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）檢測(cè)技術(shù)? LAMP技術(shù)通過(guò)兩對(duì)引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性提供反應(yīng)的動(dòng)力，在恒溫條件下完成對(duì)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)[36]。該技術(shù)于恒溫條件下幾十分鐘內(nèi)即可完成，無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備，結(jié)果可肉眼直接觀(guān)察，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)[37]。韓凱凱、董嘉文和吳植等根據(jù)GenBank中登錄的鴨坦布蘇病毒基因序列，分別建立了基于LAMP技術(shù)的鴨坦布蘇病毒檢測(cè)方法[38～40]。

5? 結(jié)語(yǔ)

鴨坦布蘇病毒病在我國(guó)流行以來(lái)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的危害，對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前市場(chǎng)上已有商品化的弱毒疫苗，并對(duì)該病起到了很好的防控作用。當(dāng)前對(duì)鴨坦布蘇病毒的研究已經(jīng)很多，但是在傳播途徑、致病機(jī)制和公共衛(wèi)生等方面還需要更深一步的研究。

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收稿日期：2019-03-22

*基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0500800）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（SDAIT-11-01）。

作者簡(jiǎn)介：任斌斌，男，山東人，碩士研究生，E-mail：renbinbinhappy@163.com。

**通訊作者：黃兵（1973.12-），男，貴州余慶人，研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物分子病毒學(xué)與免疫學(xué)，一直從事新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎等禽重要傳染性疾病快速檢測(cè)技術(shù)、無(wú)特定病原雞微生物監(jiān)測(cè)技術(shù)及基因工程藥物的研究，E-mail：hbind@163.com。