粉托鬼筆菌液體培養(yǎng)基條件優(yōu)化

鄭娜 于敬榮 程顯好

摘 要：以粉托鬼筆菌菌絲體為實驗材料，研究了在液體深層發(fā)酵過程中碳源、氮源、無機鹽、培養(yǎng)條件對菌絲體生物量的影響，經(jīng)過多個重復對比實驗，分析實驗數(shù)據(jù)，從而確定了粉托鬼筆菌液體深層發(fā)酵的最佳條件。為粉托鬼筆菌的深層發(fā)酵開發(fā)研究奠定了堅實的基礎。

關(guān)鍵詞：粉托鬼筆菌;液體深層發(fā)酵;菌絲體生物量

粉托鬼筆菌（Phallus impudicus L.ex Pers.），隸屬于鬼筆目（ Phallales），鬼筆科（Phallaceae），鬼筆屬（ Phallus），是一種大型真菌。貼生于菌柄的頂部并在菌柄頂部膨大部分相連，外表面有大而深的網(wǎng)格，成熟后頂平，有穿孔，孢子體覆蓋在菌蓋網(wǎng)格內(nèi)表面，青褐色、黏稠、有草藥樣濃郁香氣[1]。本實驗室開展了培養(yǎng)基條件的優(yōu)化實驗，深入研究粉托鬼筆菌液體培養(yǎng)基條件優(yōu)化。以獲得大量的粉托鬼筆菌菌絲體，以滿足粉托鬼筆菌藥物開發(fā)的需要。

一、材料與方法

1.材料。菌種：粉托鬼筆菌（Phallus impudicus L.ex Pers.），魯東大學菌物科學與技術(shù)研究院菌種保藏室保存。

2.培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基（組分g/dL）：馬鈴薯20，葡萄糖2，蛋白胨2，酵母膏0.8，瓊脂2，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.3。液體種子培養(yǎng)基（組分g/dL）：葡萄糖2，蛋白胨2，酵母膏0.8，MgSO4 0.3，KH2PO4 0.5。發(fā)酵基礎培養(yǎng)基（組分g/dL）：濃度同液體種子培養(yǎng)基一樣。

二、實驗方法

1.搖瓶培養(yǎng)。從已活化的菌種斜面上挑取生長旺盛部位的菌絲體，挑取兩塊菌絲體接入到裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，置于濕度適宜，溫度為25℃的搖床上培養(yǎng)7d。按體積分數(shù)10%的接種量，將10 mL搖瓶種子液在無菌條件下接入到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，25℃、150r/min條件下，搖瓶培養(yǎng)7d。

2.單因素篩選試驗。碳源篩選實驗：在基礎培養(yǎng)基基礎上以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘油、甘露醇六種碳源分別進行培養(yǎng)，得到各自的最適濃度，再在六種最適濃度碳源中得到最適的碳源，設2個重復，進行搖瓶發(fā)酵。氮源篩選實驗：在基礎培養(yǎng)基中分別以酵母粉、硝酸銨、氯化銨代替蛋白胨作為氮源，其添加量根據(jù)各自的全氮含量相對于0.5g/dL蛋白胨的全氮量折合而成，設2個重復，進行搖瓶發(fā)酵。

無機鹽篩選實驗：選用KH2PO4 、MgSO4 、CaSO4 、ZnSO4分別進行單因素實驗，確定最適的濃度。

起始pH值篩選實驗：用1mol/L NaOH 和1mol/L HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，分別為4.5， 5.0， 5.5， 6.0， 6.5，7.0發(fā)酵結(jié)束測得菌絲體干重，得到發(fā)酵起始最佳pH。接種量選擇實驗：接種量選取5%、10%、15%、20%分別進行培養(yǎng)，確定最佳接種量。

三、結(jié)果與分析

1.碳源對粉托鬼筆菌深層發(fā)酵的影響。6種碳源均可被粉托鬼筆菌菌絲體利用，說明粉托鬼筆菌對碳源的要求并不苛刻，既能利用單糖和雙糖等小分子碳源，也能利用成分復雜的復合碳源。以這6種碳源最適濃度進行單因子發(fā)酵，得到實驗數(shù)據(jù)?？梢缘贸鲆云咸烟呛涂扇苄缘矸蹫樘荚磿r，菌絲體生物量最高，但考慮到葡萄糖價格低廉，且來源方便;同時葡萄糖作為一個速效碳源，可被菌體直接利用，能夠縮短發(fā)酵延遲期。故選用濃度為2%的葡萄糖作為本試驗的最適碳源。

2.氮源對粉托鬼筆菌深層發(fā)酵的影響。粉托鬼筆菌在含蛋白胨的培養(yǎng)基中能很好生長，而在含酵母粉的培養(yǎng)基中生長不良，在含氯化銨、硝酸銨的培養(yǎng)基中則不出現(xiàn)生長現(xiàn)象，說明粉托鬼筆菌對有機氮的利用比無機氮好。但培養(yǎng)基單獨使用蛋白胨或酵母膏，菌絲體都會出現(xiàn)生長不良的現(xiàn)象，而二者一起使用的時候，菌絲體就能很好生長。故對蛋白胨和酵母膏分別進行濃度優(yōu)化，得到蛋白胨最適濃度為2%，酵母膏最適濃度為0.8%。

3.無機鹽對粉托鬼筆菌深層發(fā)酵的影響。分別對KH2PO4、MgSO4 、CaSO4 、ZnSO4進行單因素條件篩選，分析可知KH2PO4、MgSO4 、CaSO4對菌絲體生長有重要促進作用，而ZnSO4的存在與否對菌絲體產(chǎn)量沒有影響，進而分別對KH2PO4、MgSO4 、CaSO4分組培養(yǎng)，得到最適濃度KH2PO4 0.6%、MgSO4 0.45%、CaSO4 0.2%。

4.起始pH值對粉托鬼筆菌深層發(fā)酵的影響。用1mol/LNaOH和1mol/LHCl調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，分別為4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0。起始pH值的選擇結(jié)果，pH5.5時可促進菌絲體的生長，而發(fā)酵培養(yǎng)基的自然pH值偏酸，約為5.8，因此采用培養(yǎng)基的自然pH值5.8即可。

5.接種量對粉托鬼筆菌深層發(fā)酵的影響。接種量的選擇結(jié)果為5%mL時，發(fā)酵前期菌絲體生長過于緩慢，導致發(fā)酵時間延長;接種量為15%、20%時發(fā)酵前期菌絲體生長過于旺盛，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分迅速消耗，導致發(fā)酵后期菌絲體生長緩慢，不利于代謝產(chǎn)物多糖的生成;而接種量為10mL時，對菌絲體和多糖有明顯促進作用，故接種量選擇10mL。

6.粉托鬼筆菌搖瓶發(fā)酵過程中的動態(tài)變化。按照篩選出來的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行搖瓶發(fā)酵，每隔1d取樣測定生物量。經(jīng)過10d的發(fā)酵，得出粉托鬼筆菌菌絲體干重和培養(yǎng)基pH值的變化曲線。菌絲體生物量在達到峰值，在衰亡期開始自溶，生物量開始下降。pH值變化曲線為先降后升，但一直都保持在5.5～6.0之間，這一數(shù)值正是粉托鬼筆菌生長的適宜pH值的范圍?？梢猿醪酱_定8d左右為發(fā)酵的終點時間。

7.條件優(yōu)化設計小結(jié)。通過單因素試驗，發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉和葡萄糖是很好的碳源。酵母粉對菌絲體的生長有促進作用，黃豆粉作為一種復合氮源，來源方便，價格低廉，故作為粉托鬼筆菌液體發(fā)酵的主要氮源。微量元素方面，實驗結(jié)果表明，添加微量的鋅鹽對菌絲體生物量沒有影響。發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2g/dL，蛋白胨2g/ dL，酵母膏0.8g/dL，KH2 PO4 0.6g/dL，MgSO4 0.45g/dL ，CaSO4 0.2g/dL ;最優(yōu)培養(yǎng)條件為：24℃，起始pH5.8 ，搖瓶裝液量為100mL/250mL ，接種量10mL ，搖床轉(zhuǎn)數(shù)140r/min ，發(fā)酵時間為8d。

四、結(jié)語

通過單因素篩選實驗，我們了解了在深層發(fā)酵過程中碳源、氮源、無機鹽、培養(yǎng)條件等對菌絲體生物量的影響。分析整理實驗數(shù)據(jù)，可以將得出的實驗數(shù)據(jù)靈活的運用到生產(chǎn)實際中，為解決時間中的問題提供理論依據(jù)。 在粉托鬼筆菌液體培養(yǎng)條件研究成熟的基礎上，可以考慮進行工廠化生產(chǎn)。

參考文獻：

[1]王建瑞，圖力古爾. 吉林省擔子菌補記（六）[J]. 菌物研究.2004.2（ 4）： 40-43.

[3]程顯好，田吉騰，張秋勝，王琦，馮志彬，朱林，圖力古爾. 粉托鬼筆菌絲體和子實體的培養(yǎng)特性[J].第九屆全國食用菌學術(shù)研討會論文集.2010.

[3]歐超，李正鵬，王娣.羊肚菌液體深層發(fā)酵條件[J].食品與生物技術(shù)學報.2007.3.