水稻田鐵氧化菌的豐度及微生物群落結(jié)構(gòu)組成

狄霖 劉玲玲 鐘志仁 黃顧林 盛海君 王娟娟 朱友理

摘要：水稻土中鐵氧化物的存在對于土壤中的重金屬離子及有機污染物有較強的吸附固定能力，研究參與其形成的微生物有重要的生態(tài)意義。分別采用濃度梯度試管富集培養(yǎng)不同水稻根部土壤中的鐵氧化菌，用最大可能數(shù)（most probable number，簡稱MPN）方法計算其豐度;測定土壤主要微生物群落結(jié)構(gòu)，并結(jié)合各種土壤理化因素進行多元生態(tài)統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，幾種不同肥力的水稻土中可培養(yǎng)的微好氧鐵氧化細菌數(shù)平均達169萬個/g，其豐度與土壤pH值呈正相關(guān)，而與其他主要土壤理化性質(zhì)沒有顯著相關(guān)性。在門的水平上，所測樣品中以Proteobacteria（變形菌門）為主要類別，平均占細菌總量的46.35%。在屬水平上，則以Nitrospira（硝化螺旋菌屬）、Anaeromyxobacter（厭氧黏細菌）、Geobacter（地桿菌屬）、Anaerolinea（厭氧繩菌屬）等為主，代表性的鐵氧化菌Gallionella（披毛菌屬）在所有相對豐度中排名第7，達2.2%?？傮w而言，各種樣品的理化性質(zhì)相近，但是微生物群落的結(jié)構(gòu)差異較大，其分布受到樣品理化性質(zhì)的影響較為復(fù)雜。

關(guān)鍵詞：水稻土;鐵氧化細菌;微生物群落結(jié)構(gòu);豐度

中圖分類號： S182? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0296-05

鐵（Fe）是地球表面豐度排名第2的金屬元素，普遍存在于各種土壤中。鐵在自然界中的主要存在形態(tài)為二價鐵[Fe（Ⅱ）]與三價鐵[Fe（Ⅲ）]，前者可以通過化學(xué)過程與微生物作用，由鐵氧化生成Fe（Ⅲ）氧化物[1]。鐵的氧化物、氫氧化物在自然界中以多種形態(tài)存在，鐵氧化物及其氫氧化物具有特殊的電化學(xué)性質(zhì)、較大的比表面積和豐富的—OH功能團，可與多種離子發(fā)生吸附-解吸反應(yīng)，對重金屬離子及有機污染物在地表環(huán)境中的遷移和沉淀均有重要影響。由微生物活動而產(chǎn)生的鐵氧化物，因其巨大的比表面積并可與微生物有機體、各種有機代謝物結(jié)合，對土壤中包括重金屬在內(nèi)的多種污染物有較強的吸附能力，在修復(fù)、凈化污染土壤的研究中受到相當(dāng)多的關(guān)注[2-4]。研究表明，約有50%～90%的鐵氧化物是由微生物活動形成的[5-6]。

水稻在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有非常重要的地位，水稻田是具有重大經(jīng)濟意義的土壤資源，因其灌溉條件特殊，水稻田中的重金屬，特別是砷（As）、鎘（Cd）等的污染比其他農(nóng)田嚴(yán)重，從而嚴(yán)重威脅到糧食安全。研究表明，水稻如果長期生長在淹水環(huán)境中，厭氧土壤中大量存在的Fe（Ⅱ）會被水稻根系分泌的氧氣、氧化性物質(zhì)氧化成三價鐵并沉積在水稻根表及質(zhì)外體[7]。這些鐵氧化物可以對植物吸收和運輸重金屬元素起到阻礙作用，其形成過程與環(huán)境生態(tài)效應(yīng)已經(jīng)引起許多研究者的重視[8-9]。關(guān)于根表鐵膜對養(yǎng)分的富集、吸附和重金屬污染的控制問題，已經(jīng)有較多的報道。如有報道表明，水稻根表鐵與鎘的吸收有一定的關(guān)系[10-12]。研究表明，水稻田中毒性較大的三價砷含量與鐵氧化菌數(shù)量呈反相關(guān)[13]。在微生物氧化鐵的過程中，三價砷[As（Ⅲ）]同時被氧化成五價砷[As（Ⅴ）]，從而降低砷的移動性[14]。然而，有關(guān)鐵氧化菌在不同稻田的分布情況及其受環(huán)境因子影響的報道仍較為缺乏。

pH值是決定鐵循環(huán)的關(guān)鍵因素，在近中性環(huán)境且有氧的條件下，化學(xué)氧化過程尤為迅速，鐵氧化細菌必須與非生物鐵氧化過程競爭二價鐵源。隨著pH值的下降，微生物在鐵氧化物形成過程中的作用更加明顯。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)在弱酸性條件（pH值為5～6）下，有一類微生物喜好亞鐵源的微氧環(huán)境，如濕地植物根際[15-17]，并可能在鐵氧化過程中起主要作用。關(guān)于水稻土鐵氧化微生物受pH值影響的研究具有重要意義。此外，鐵氧化微生物也會影響土壤微生物的豐度、活性、微生物生物量和微生物群落結(jié)構(gòu)[18-19]，而土壤微生物則對土壤肥力的改善起到積極作用。關(guān)于水稻土肥力對鐵氧化菌的影響尚未見報道。

本研究選擇鐵元素含量相對較高的水稻田，根據(jù)有機質(zhì)與其他養(yǎng)分含量，將其分為3種不同的肥力，采集水稻根部附近的土壤，測定其細菌群落結(jié)構(gòu)及參與鐵氧化過程的主要細菌種類與豐度，旨在比較不同水稻田微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因素之間的關(guān)系，了解富鐵稻田主要微生物的群落結(jié)構(gòu)，從而為進一步明確微生物在鐵氧化物生成及重金屬吸附過程中的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

水稻土樣品于2016年10月25日采自鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)（位于31°42′00″N～32°12′0″N，119°0′0″E～119°4′0″E范圍內(nèi)的區(qū)域）。該區(qū)水稻田多為水稻土，由于灌水和季節(jié)性的降水，使地下水位反復(fù)升降，造成土壤干濕交替頻繁，氧化和還原過程不斷更替，耕作層含鐵量極高，紅棕色鐵銹常見于水稻根表與近表層土壤。在本樣區(qū)選擇6塊水稻田（編號為S1～S6），其中S3、S5為低肥力地塊，S1、S4為中肥力地塊，S2、S6為高肥力地塊。每塊田采用五點法取水稻根附近0～10 cm土層的樣品，混勻，再抽取3個重復(fù)的樣品。每個土壤樣品分為3個部分保存，一部分保存在冷卻箱內(nèi)，用于鐵細菌的培養(yǎng)與豐度的測定，另外一部分用于DNA分離及測序的樣品立刻用干冰冷凍保存，其他土壤則風(fēng)干保存，用于常規(guī)理化性質(zhì)的測定。

1.2 微好氧鐵氧化細菌的富集培養(yǎng)與最大可能數(shù)（most probable number，簡稱MPN）的測定

微好氧鐵氧化細菌生長速度較慢，且對氧氣、營養(yǎng)濃度的要求較高。采用改進的半固態(tài)梯度管（15 mL）進行培養(yǎng)。該系統(tǒng)由2個部分組成：試管的底部為FeS與同體積的改良MWMM培養(yǎng)基的混合物，并添加1%瓊脂糖;試管上部為半固態(tài)，含MWMM、Wolfe維生素與礦質(zhì)元素以及0.15%瓊脂糖。在做準(zhǔn)備培養(yǎng)制備梯度試管時，將上、下部分別高壓滅菌后，先在試管中加入1 mL熱的FeS與MWMM混合培養(yǎng)基，待其冷卻凝固。在上部培養(yǎng)基中于滅菌前先加入最終濃度為 5 mmol/L 的碳酸氫鈉，高壓滅菌后冷卻至50 ℃左右，用過濾無菌的二氧化碳、氮氣混合氣體（體積比為3 ∶ 7）吹氣，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至 5.5～6.0，加入維生素與礦質(zhì)元素。等底部含亞鐵的培養(yǎng)基凝固后，在每個試管中加入9 mL上部培養(yǎng)基。待濃度梯度試管準(zhǔn)備好后，冷藏24 h即可接種。將土壤按1～10倍濃度梯度依次稀釋到0.9% NaCl溶液中。根據(jù)經(jīng)驗，該細菌在環(huán)境中的數(shù)量不超過108倍稀釋液，所以將土壤稀釋到109倍液。取約10 μL稀釋液接種，空白對照用 10 μL 0.9% NaCl溶液替代，每個濃度、每種培養(yǎng)基重復(fù)3次。將接種好的試管于25 ℃培養(yǎng)室中進行無光照培養(yǎng)。當(dāng)上層培養(yǎng)基出現(xiàn)膜狀橙紅色的鐵氧化物條帶，則表示有細菌生長，同時用顯微鏡觀察驗證細菌的生長情況。

1.3 土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)分析

稱取0.3 g樣品用于DNA分析，采用PowerSoil DNA提取試劑盒提取DNA。采用通用細菌引物515F、806R擴增16S rRNA基因的V4區(qū)片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢驗合格后，通過Hiseq2500平臺（美國Illumina公司）進行測序。去除Barcode及引物序列后，通過Qiime軟件對初始序列進行過濾與質(zhì)量控制，再利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001）對所有樣品進行聚類。用RDP Classifier（Version 2.2）方法與GreenGene數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析，得到不同分類水平的比例。

1.4 樣品理化指標(biāo)分析

理化指標(biāo)的分析方法參照《土壤農(nóng)化分析》。土壤pH值采用pH計法測定，水土比為2.5 mL ∶ 1 g。土壤有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定;全氮含量采用凱氏法測定;速效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗分光光度法測定;速效鉀含量采用1.0 mol/L NH4OAc浸提-火焰光度法測定。土壤有效重金屬濃度用0.05 mol/L DTPA（二乙基三胺五乙酸）提取，再用原子吸收法測定。土壤中生物有效鐵濃度用 0.5 mol/L HCl提取，再用啉啡羅琳方法測定[20]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)圖表的生成用Excel 2010。單因素方差分析用OriginPro 9軟件，樣品間差異分析用Fisher最小顯著性差異法（LSD），其中P<0.05表示差異顯著。用生態(tài)統(tǒng)計分析軟件Canoco 5.0來分析樣品微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因素的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性狀

從表1可以看出，所測樣點土壤的pH值介于5.1～5.8之間，均為弱酸性。土壤有機質(zhì)含量為18.3～27.7 mg/kg，其中樣品S2的含量顯著高于S3、S5的含量。各處理樣品的總鐵含量均較高，有效鐵含量最高達244.8 mg/kg，且部分樣點之間差異顯著。樣品全氮含量平均為1.49 g/kg。堿解氮含量平均為 117.2 mg/kg，占總氮的10%左右，除了樣品S5的含量較低（98.5 mg/kg），S2最高（139.1 mg/kg），其余水稻土的堿解氮含量差異不明顯。土壤速效磷含量平均為 24.6 mg/kg，速效鉀含量平均為133.0 mg/kg，大部分樣品間差異不顯著。

2.2 水稻根部可培養(yǎng)鐵氧化細菌的豐度

如圖1所示，利用濃度梯度試管培養(yǎng)的方法，6個水稻土樣品均有微好氧鐵氧化細菌生長，平均數(shù)量為1.69×106個/g。其中S3、S4處理的鐵氧化細菌豐度明顯高于S1、S2處理，分別達到3.04×106、3.2×106個/g，而S5、S6處理則介于其中，與其他樣品間的差異不大。鐵氧化細菌的數(shù)量與土壤pH值呈正相關(guān)（Pearson相關(guān)系數(shù)為0.9，r2=0.81）。而鐵細菌豐度與土壤有效鐵濃度之間無相關(guān)性，也不受其他土壤性質(zhì)如有機質(zhì)、氮磷鉀含量等的影響。

2.3 水稻根系微生物群落的結(jié)構(gòu)分析

從圖2-a可以看出，在門的水平上，所有樣品中Proteobacteria（變形菌門）為主要成分，平均占總細菌總量的46.35%。其他重要細菌包括Acidobacteria（酸桿菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Planctomycetes（浮霉菌門）等。各樣品的細菌組成在門級上有所差異，雖然上述細菌在所有樣品中均被檢測到，但是其所占比例差異懸殊，其中樣品S2中綠彎菌門所占比例遠高于其他樣品的總和。

對樣品的16S序列進行進一步分析發(fā)現(xiàn)，在細菌屬級水平上，各樣品的差異更大（圖2-b）?？偟膩碚f，Nitrospira（硝化螺旋菌屬）、Anaeromyxobacter（厭氧黏細菌屬）、Geobacter（地桿菌屬）、Anaerolinea（厭氧繩菌屬）、Rhodoplanes（紅游動菌屬）等為主要的細菌種類。主要代表性鐵氧化菌Gallionella（披毛菌屬）在所有測定序列中相對豐度排名第7，達2.2%;主要代表性鐵還原菌地桿菌屬則約占總序列的7.3%。

2.4 不同處理下水稻根部土壤的重金屬含量

由表2可以看出，鉻含量在所有金屬中最高，平均達到67.83 mg/kg，其次為鉛，含量為7.8～13.7 mg/kg。樣品平均砷含量為9.48 mg/kg，而平均汞含量則為 0.12 mg/kg。土壤鎘含量介于0.05～0.11 mg/kg之間，平均為 0.07 mg/kg?？傮w而言，不同樣品的重金屬含量之間差異較小，只有樣品S5的含鉻量明顯低于其他樣品。

2.5 環(huán)境因素對水稻土微生物結(jié)構(gòu)的影響

采用冗余分析（redundancy analysis，簡稱RDA）對不同樣點的細菌群落結(jié)構(gòu)與部分環(huán)境因素之間的關(guān)系進行分析。由圖3可見，樣品S3、S5、S6的細菌群落結(jié)構(gòu)在門級水平上較為相似，其他樣點間的差異則較大。圖3中的前2個軸線（橫向、縱向）可分別解釋總變化45.7%中的28.3%，說明分析結(jié)果比較可靠。在各種已知環(huán)境因素中，樣品S3、S5、S6的細菌群落結(jié)構(gòu)受pH值的影響相對較大，而樣品S2的細菌群落組成則與其他養(yǎng)分因子有機質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀等含量的相關(guān)性較好，與樣品pH值呈反相關(guān)。樣品S1的細菌群落組成與S4明顯不同，且均不受所測環(huán)境因子的影響。從RDA分析結(jié)果可以推測，土壤的養(yǎng)分供應(yīng)狀況總體上與其細菌群落結(jié)構(gòu)沒有顯著相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

近年來，越來越多的學(xué)者們對植物根系，尤其是水稻根系的鐵氧化與還原微生物進行了研究。結(jié)果表明，微生物在調(diào)控環(huán)境鐵氧化物形成方面起著不可忽視的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，水稻根部土壤樣品中可培養(yǎng)鐵氧化菌含量達169萬個/g，且高通量測序結(jié)果顯示，近2%的微生物與鐵氧化細菌有關(guān)。Weiss等對13個樣品25種植物的分析結(jié)果表明，鐵細菌在濕地植物的根際中普通存在，其平均密度達105 cells/g。鐵細菌數(shù)量與鐵氧化物濃度雖然沒有顯著的相關(guān)性，但是研究者在氧化鐵含量最低的地方發(fā)現(xiàn)了相對數(shù)量最少的鐵細菌[21]。本研究并沒有發(fā)現(xiàn)鐵氧化菌的豐度與有效鐵含量有關(guān)，這一方面可能是由于土壤中有效鐵含量較高，遠超過鐵氧化菌所需;另一方面，土壤氧化態(tài)鐵與有效鐵含量并不是呈正相關(guān)關(guān)系。今后的試驗主要需要測定氧化態(tài)鐵的含量與形態(tài)。

研究者發(fā)現(xiàn)，以Gallionella（披毛菌屬）為代表的鐵氧化菌廣泛存在于弱酸性條件下（pH值為5～6）[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)，Gallionella為最主要的變形桿菌之一，此外還有Siderooxydans、Thiobaccillus（硫桿菌屬）等鐵氧化菌?？膳囵B(yǎng)微好氧化鐵氧化菌以及與鐵氧化菌相關(guān)的16S rRNA基因的拷貝數(shù)均與土壤pH值呈顯著正相關(guān)。可見，在含鐵量較高的酸弱性水稻土壤中，隨著pH值的升高，土壤中鐵氧化細菌的相對豐度也隨之提高。而對于由有機質(zhì)代表的各土壤肥力指標(biāo)，與所測鐵氧化菌的豐度并無相關(guān)性。

由于植物根系的呼吸作用，根部各種生理生化過程均比較迅速。鐵元素的循環(huán)也是一個動態(tài)過程 其中鐵的氧化和還原總是同時發(fā)生的。三價鐵的形成，尤其是非結(jié)晶態(tài)鐵，為鐵還原菌提供了電子受體。Weiss等發(fā)現(xiàn)，香蒲根際近12%的菌群為鐵還原細菌，而本試驗發(fā)現(xiàn)，鐵還原菌包括厭氧黏細菌、地桿菌的16S rRNA序列占序列總數(shù)的比例較高[23]。根系在生長過程中會產(chǎn)生各種有機物，其中小分子有機酸如乙酸的含量較高，且在淹水條件下其濃度會大幅增加。這些為包括Geobacter spp.在內(nèi)的鐵還原菌的生長創(chuàng)造了有利條件[24]。水稻根尖的泌氧作用使得鐵（Ⅱ）被氧化，同時消耗O2，產(chǎn)生厭氧條件。鐵還原菌則利用還不穩(wěn)定的無定形態(tài)三價鐵與根系附近大量的有機碳源進行三價鐵還原，這個循環(huán)過程在根的旺盛生長期應(yīng)該是持續(xù)進行的，而在水稻生長發(fā)育初期、成熟后期，尤其是在后期，大多數(shù)老根開始衰亡腐解，造成局部的強還原狀態(tài)。前人研究表明，在水稻生長后期，水稻根際鐵氧化物與重金屬的相關(guān)性較小[25]。本試驗發(fā)現(xiàn)，可培養(yǎng)的鐵還原菌總數(shù)高于鐵氧化菌，可能與樣品采集于水稻成熟期有關(guān)。如進一步研究不同水稻生長季節(jié)根際微區(qū)內(nèi)各種微生物的群落結(jié)構(gòu)與活性，且根據(jù)土壤的實際理化性質(zhì)增加培養(yǎng)基種類，以盡可能覆蓋可培養(yǎng)鐵細菌的范圍，將更有利于解釋鐵循環(huán)進程的速率變化，并更精確地定量微生物在鐵氧化物生成過程中的作用。

在水稻根際形成的鐵氧化物，由于其特殊的表面物理與化學(xué)結(jié)構(gòu)，對環(huán)境中各種重金屬與有機污染物有較強的吸附作用[3，26]，該過程可能會阻止污染進入水稻體內(nèi)。田間觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水稻土中的鐵塊/斑的數(shù)量與分布差異較大。在同一取樣點，鐵斑的垂直分布也有所不同。此外，總鐵氧化微生物的豐度與重金屬污染物之間的關(guān)聯(lián)較小。該方面的影響可以通過對土壤剖面不同深度的微生物與重金屬的分布情況作進一步探究。

綜上所述，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，弱酸性水稻田鐵氧化與還原細菌豐度較高，為微生物群落的主要組成部分。盡管不同采樣點土壤的理化性質(zhì)相似，其微生物群落組成卻有所差異。各采樣點可培養(yǎng)的鐵還原細菌豐度略高于鐵氧化細菌，這2類微生物含量均與土壤pH值呈正相關(guān)，而不受土壤肥力狀況及土壤有效鐵含量影響。在本試驗條件下，土壤中鐵氧化細菌豐度與重金屬含量之間并無顯著相關(guān)性。

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