山東蒼山大蒜貯藏期新病原細(xì)菌的分離與鑒定

鐘文文 孟杰 張魯燕 于金英 許俊杰

摘要：對(duì)山東省臨沂市蘭陵縣蒼山大蒜貯藏期病害情況進(jìn)行了調(diào)查，從病斑上分離得到4種真菌和1種細(xì)菌，經(jīng)致病性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌株LYU20170013號(hào)具有致病性。采用柯赫氏法則和病斑顯微觀察法對(duì)病原菌菌株LYU20170013進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA序列分析，將LYU20170013菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。該菌在大蒜鱗莖上尚屬首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;大蒜鱗莖病害;柯赫氏法則;病原菌

中圖分類號(hào)： S432.4+2;S436.33? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0205-04

大蒜（Allium sativum）是著名的兼有藥效的蔬菜，屬百合科蔥屬多年生草本植物，以鱗莖入藥，具止痢、止咳、健胃、殺菌、驅(qū)蟲之功效，原產(chǎn)中亞，南、北各省均有栽植，栽培歷史悠久[1]。蒼山大蒜也稱作“蘭陵大蒜”，亦稱“葫”或“葫蒜”，產(chǎn)于“中國(guó)蒜鄉(xiāng)”山東省臨沂市蘭陵縣，蒼山大蒜歷史悠久，東漢崔實(shí)著《東觀漢記》載：“李恂，為兗州刺史，所種小麥、葫蒜，悉付從事，無(wú)所留”。它是在蘭陵縣特定的生態(tài)環(huán)境條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人為定向培育而形成的蘭陵特有品種，為山東省傳統(tǒng)名特蔬菜之一，是中國(guó)出口的優(yōu)質(zhì)大蒜。

蒼山大蒜外貿(mào)出口已有20多年歷史，遠(yuǎn)銷日本、韓國(guó)、新加坡、馬來(lái)西亞、柬埔寨、泰國(guó)等國(guó)家和地區(qū)。2016年“蒼山大蒜”榮獲農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志金獎(jiǎng)，成為山東省唯一一個(gè)獲得此獎(jiǎng)項(xiàng)的產(chǎn)品。蒼山大蒜基地現(xiàn)有面積2.4萬(wàn)hm2，東至臨沂市蘭陵縣神山鎮(zhèn)東楊莊村;西至向城鎮(zhèn)楊莊村;南至長(zhǎng)城鎮(zhèn)前蘆洼子村;北至大仲村鎮(zhèn)泉汪村;轄10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)560個(gè)行政村，地理坐標(biāo)為117°56′～118°17′E、34°39′～34°59′N。年產(chǎn)量32萬(wàn)t。

蒼山大蒜隨著種植面積的逐年擴(kuò)大，大蒜有害生物亦呈快速增加趨勢(shì)，危害越來(lái)越大。在大蒜生長(zhǎng)期間和倉(cāng)儲(chǔ)期間，有害生物的危害，造成蒜薹、蒜頭減產(chǎn)和霉?fàn)€[2]。蒜頭（大蒜鱗莖）在貯藏調(diào)運(yùn)期間可發(fā)生多種病害，引起蒜頭腐爛和污損，嚴(yán)重降低其商品價(jià)值和種用價(jià)值。大蒜鱗莖（蒜頭）是重要的市場(chǎng)和產(chǎn)地檢疫農(nóng)產(chǎn)品[3]，蒜頭病害還是出境植物檢疫的重要對(duì)象，鱗莖腐爛是引起大蒜減產(chǎn)的主要因素[4]。因此，進(jìn)一步加強(qiáng)大蒜貯藏期病害的研究有著重要的意義。本研究旨在通過(guò)對(duì)大蒜貯藏期蒜瓣新病害病原細(xì)菌的研究，為大蒜病害的防控提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查和樣本采集

2016年1月至2017年11月對(duì)臨沂市蘭陵縣大蒜貯藏期病害情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)蒼山大蒜在貯藏期間發(fā)生較為嚴(yán)重的病害，對(duì)感病情況、病原種類及發(fā)生癥狀進(jìn)行觀察、記錄和拍照。采集大蒜鱗莖樣本650份，統(tǒng)計(jì)蒜頭和蒜瓣感病率，并選取部分蒜瓣進(jìn)行病原菌研究。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 病原菌的分離和純化 病原菌的分離采用內(nèi)生細(xì)菌的分離方法進(jìn)行分離，將得到的分離物分別編號(hào)，并置于細(xì)菌培養(yǎng)基上于37 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，在顯微鏡下觀察，待單細(xì)胞形態(tài)特征完全一致時(shí)，即轉(zhuǎn)接到細(xì)菌斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到的菌株為純菌株。

1.2.2 病原細(xì)菌的常規(guī)生理生化特性測(cè)定 傳統(tǒng)形態(tài)和生理生化鑒定：通過(guò)革蘭氏染色、觀察形態(tài)和使用細(xì)菌微量生化鑒定管測(cè)定生理生化特性。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)》[5]和《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[6]中的方法進(jìn)行種類鑒定。細(xì)菌微量生化鑒定管購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 致病性測(cè)定 分別以病原菌的菌落和孢子懸浮液作為接種體對(duì)其在蒜瓣上的致病性進(jìn)行測(cè)定。選擇健康的蒜瓣進(jìn)行接種，蒜瓣先用70%的乙醇表面消毒，再分有傷口（用無(wú)菌新牙刷在蒜瓣表面刷3下）接種和無(wú)傷口接種，以清水為對(duì)照，接種后保濕24 h，每隔1～2 d觀察癥狀。發(fā)病后，從病斑再次分離病原菌，并與原接種菌進(jìn)行比較。Kock氏致病性測(cè)定參照Xie等的方法[7]進(jìn)行。

1.2.4 病原菌的確認(rèn) 蒜瓣組織解剖觀察：選取含有病斑的蒜瓣，用清水沖洗干凈，然后再用無(wú)菌水洗1～3遍，保證蒜瓣表面沒(méi)有其他微生物和塵土顆粒附著。利用徒手切法，采用縱向和橫向的方法切取病斑及其周圍的組織，選取合適材料制成玻片，用于病原菌的顯微觀察和驗(yàn)證。

1.2.5 病原菌形態(tài)學(xué)的特征觀察 病原菌的培養(yǎng)性狀觀察：將病原菌移接于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7～8 d，記錄菌落形態(tài)和顏色，觀察其菌落特征和大小，并描述其菌落特征。

1.2.6 16S rDNA同源性分析 采用OMEGA細(xì)菌DNA提取試劑盒/Bacterial DNA Kit（50次）提取菌株基因組總DNA。本試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。引物設(shè)計(jì)上游引物5′-GGATACCTTGTTACGACTT-3′和下游引物5′-AGAGTTTGATCCTGCCTCAG-3′，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物各1.0 μL，DNA模板 5.0 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連入pMD19-T載體，熱激法轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選擇轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測(cè)序中心進(jìn)行DNA雙向測(cè)序。利用DNAMAN分析軟件將待測(cè)菌株的16S rDNA核苷酸序列與GenBank上收錄的代表菌株16S rDNA基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)合DNAMAN、GenBank BLAST軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜瓣的病害與癥狀特點(diǎn)

2016年1月至2017年11月對(duì)蒼山縣采收的新鮮大蒜、市售大蒜和倉(cāng)儲(chǔ)大蒜進(jìn)行了抽樣調(diào)查，調(diào)查發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)藏期大蒜蒜頭病害種類復(fù)雜，病害發(fā)生較為嚴(yán)重，嚴(yán)重影響大蒜的質(zhì)量和蒜農(nóng)的收益。其發(fā)生規(guī)律和危害癥狀不盡相同。感病情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，蒜頭感病率10%，蒜瓣感病率6%，真菌發(fā)病感病率95%，細(xì)菌感病率5%。從感病癥狀可知，蒜瓣病斑多呈干癟、凹陷、水漬狀，常覆蓋絨毛或者粉狀物，且顏色各不相同，有青色、黑色、白色、褐色等。發(fā)病蒜瓣有時(shí)散發(fā)惡臭味?？傊?，大蒜鱗莖受害后的癥狀因?yàn)椴≡锏牟煌饔胁煌Ｕ{(diào)查還發(fā)現(xiàn)，凡是感病蒜瓣多有機(jī)械損傷痕跡，由此說(shuō)明貯藏期大蒜感病的主要原因是：蒜瓣自身在田間、運(yùn)輸或者貯藏過(guò)程受到了機(jī)械損傷，導(dǎo)致腐生菌寄生所致。造成根部腐爛的主要原因是根部帶菌浸染，初侵染菌源多來(lái)自田間土壤;在貯運(yùn)期間由根部蔓延到蒜頭基部，蒜瓣變黃褐色、干枯。貯運(yùn)病害發(fā)生的主要內(nèi)在因素是蒜頭內(nèi)在質(zhì)量較差，生活力降低或收獲貯運(yùn)期間受到機(jī)械損傷。大部分貯蒜病害的病原菌腐生性較強(qiáng)，分布很廣，蒜頭不論在田間還是在貯運(yùn)過(guò)程中都要被病原菌污染，貯藏期間通風(fēng)不暢，蒜頭受潮發(fā)熱，則是主要的外部因素。做好田間病害防治，保持貯運(yùn)環(huán)境衛(wèi)生，避免采收、運(yùn)輸和貯藏期機(jī)械損傷，減少菌源來(lái)源無(wú)疑是極其重要的。采收、貯運(yùn)條件對(duì)蒜頭病害的發(fā)生起著關(guān)鍵作用。

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 病原菌的分離和純化 從蘭陵縣、臨沂市場(chǎng)和超市采集樣品650份，從中選取30個(gè)代表性蒜瓣，于PDA培養(yǎng)基平板上分離病原菌，25 ℃下培養(yǎng)，各標(biāo)樣均長(zhǎng)出不同的菌落，通過(guò)菌落特征和顯微特征觀察，參照有關(guān)資料，將大蒜蒜瓣病斑分離物初步鑒定為5種，并分別編號(hào)為L(zhǎng)YU20170011～LYU20170015，其菌落形態(tài)分別見(jiàn)圖1-A至圖1-E。初步擬定為：A曲霉Aspergilus sp.，B青霉Penicillium sp.，C芽孢桿菌Bacillus sp.，D、E鐮刀菌Fusarium spp.。以上分離物的屬種歸屬和致病性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究只對(duì)芽孢桿菌Bacillus sp. LYU20170013菌株進(jìn)行深入研究，其他分離物的致病性尚在研究之中。

2.2.2 理化性質(zhì)的鑒定 從大蒜蒜瓣分離得到的12株菌株，在PDA或者牛肉膏蛋白胨細(xì)菌培養(yǎng)基上其菌落特征完全一致。菌落呈不規(guī)則狀，有皺褶，邊緣波紋狀或者鋸齒狀，灰白色，革蘭氏染色陽(yáng)性，接觸酶試驗(yàn)、木糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、棉子糖發(fā)酵、硝酸鹽還原試驗(yàn)均呈現(xiàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，酪素水解試驗(yàn)、淀粉水解陽(yáng)性，麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)和甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)均呈現(xiàn)陽(yáng)性，能在7% NaCl中生長(zhǎng)，兼性厭氧。以上特征與解淀粉芽孢桿菌Bacillus sp.的理化性質(zhì)最為類似，故將其擬定為解淀粉芽孢桿菌。

2.2.3 病原菌的確認(rèn) 柯赫氏法則驗(yàn)證：將純化后的細(xì)菌菌株LYU20170013重新接種到健康的大蒜蒜瓣上，回接在 35 ℃ 下恒溫培養(yǎng)7～9 d，觀察發(fā)現(xiàn)接種的大蒜蒜瓣全部發(fā)病，有刺傷的蒜瓣發(fā)病比無(wú)刺傷的蒜瓣早1～2 d，癥狀與田間觀察到的相同，對(duì)照不發(fā)?。▓D2）。用發(fā)病的病斑進(jìn)行常規(guī)分離，再次獲得與原分離菌基本一致的病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌即為大蒜蒜瓣的病原菌。

2.2.4 病原菌的形態(tài)特征 自然基質(zhì)組織解剖觀察：選取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水沖洗干凈，再用70%的乙醇浸泡 1～3 min，無(wú)菌水洗1～3遍，保證葉片表面沒(méi)有其他微生物和塵土顆粒附著。利用徒手切法，采用縱向和橫向的方法切取病斑及其周圍的組織，制備組織玻片，進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果如圖3。從圖3-A看出，病原菌短桿形，23 μm×（0.6～0.8） μm，單個(gè)細(xì)胞，著色均勻。感病蒜瓣組織解剖特征見(jiàn)圖 3-B。病原分離物在PDA培養(yǎng)基上菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，菌落邊緣不整齊或者呈鋸齒狀，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。菌落形態(tài)如圖3-D，挑去菌落，制片觀察，其顯微特征如圖3-C，從圖3-C看出，其形態(tài)學(xué)特征與自然基質(zhì)上圖3-A的特征完全一致。

2.2.5 病原菌16S rDNA的序列分析及同源性比較 形態(tài)學(xué)特征是真菌傳統(tǒng)分類的主要依據(jù)。但是，真菌形態(tài)學(xué)特征受培養(yǎng)基和基質(zhì)的影響較大，所以單純進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類還缺乏一定的科學(xué)性。為保證病原菌鑒定的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)得到的幾種病原分離物進(jìn)行了分子生物學(xué)輔助鑒定。對(duì)LYU20170013號(hào)細(xì)菌進(jìn)行了16S rRNA序列測(cè)定。LYU20170013號(hào)菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖4，得到1個(gè)大小約1 413 bp的片段基因序列。

將菌株LYU20170013的rDNA-ITS基因序列與GenBank中已有的DNA序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖5可看出，與其同源性99%的菌株種類為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（KR708881.1）、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（KF475836.1、JQ806052.1、FJ581439.1）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus mthylotrophicus（KX129838.1、CP009679.1、CP023320.1），從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，該菌與解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens（KJ77953.1）的遺傳距離最近，再結(jié)合其形態(tài)學(xué)顯微特征，最終確定該病原菌為解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)蒼山大蒜貯藏期蒜頭感病情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)蒜頭感病率在10%以上 蒜瓣感病率在6%以上。選取代表性感病蒜瓣對(duì)病斑菌群進(jìn)行了分析，共發(fā)現(xiàn)5種微生物，其中LYU20170013號(hào)菌株為解淀粉芽孢桿菌，其他菌株為真菌，它們分別為青霉、曲霉、變紅鐮刀菌、尖孢鐮刀菌。本研究只對(duì)LYU20170013號(hào)菌株進(jìn)行了詳細(xì)研究，根據(jù)致病性測(cè)定和柯赫氏法則，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)技術(shù)，最后確定病原LYU20170013號(hào)菌株為解淀粉芽孢桿菌，該菌在大蒜上尚屬首次報(bào)道。其他真菌的致病性正在陸續(xù)研究之中。

大蒜病原物多為腐生真菌，少數(shù)為細(xì)菌，其菌群多為混合菌群。商鴻生等報(bào)道了大蒜紅腐病的3種鐮刀菌[8]。盛紅梅等報(bào)道了甘肅省大蒜病害14種，其中真菌性病害9種，細(xì)菌性病害1種，主要包括：白腐病、白斑病、紫斑病、花葉病、黑頭病、葉霉病、青霉病、煤斑病、銹病、軟腐病等[9]。屈世喜報(bào)道山東魯西南地區(qū)大蒜生長(zhǎng)期主要病害有病毒病、銹病、葉枯病、葉斑病、菌核病、白腐病、細(xì)菌性軟腐病等;貯藏期病害主要有青霉病、灰霉病、紫斑病等[10]。大蒜鱗莖細(xì)菌性腐爛病菌，除芽孢桿菌和歐文氏菌外，其余病原細(xì)菌在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道[4]，但是，韓國(guó)的Qiu等報(bào)道在黑蒜加工過(guò)程中，大蒜內(nèi)生枯草芽孢桿菌B. subtilis，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌B. methylotrophicus和解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens是分離得到的7種細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌群[17]。Kim等報(bào)道了Bacillus amyloliquefaciens MJ1-4發(fā)酵的Cheonggukjang（清麴醬）中大蒜β-葡萄糖苷酶活性、總酚含量、異黃酮含量及抗氧化活性的變化特點(diǎn)[18]。本研究在此基礎(chǔ)上，確認(rèn)了大蒜病原細(xì)菌LYU20170013號(hào)菌株的種類為解淀粉芽孢桿菌，該病原菌在大蒜上尚屬首次報(bào)道。

大蒜真菌類疾病，主要危害近地面假莖基部或貯存的鱗莖。嚴(yán)重時(shí)影響大蒜的產(chǎn)量和質(zhì)量。大蒜病害主要有大蒜葉枯病、大蒜莖腐病、大蒜紫斑病、大蒜細(xì)菌性軟腐病、大蒜灰霉病、大蒜銹病及大蒜病毒病等[11]。本研究首次報(bào)道大蒜鱗莖的新病害，病原物為解淀粉芽孢桿菌。

大蒜為百合科蔥屬多年生草本植物，是各國(guó)人民喜愛(ài)的香辛類蔬菜，在世界各地普遍種植。大蒜不僅是人們常用的安全無(wú)毒、無(wú)公害、無(wú)殘留的調(diào)味品，而且是成本低、無(wú)毒、無(wú)副作用、具有獨(dú)特的藥理和營(yíng)養(yǎng)保健功能，可以有效地預(yù)防癌癥的發(fā)生[12-15]。大蒜由于具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健和藥用價(jià)值而成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)[16]。解淀粉芽孢桿菌是具有良好生物防治功能的益生菌，廣泛應(yīng)用于植物病原真菌和細(xì)菌的防治[17]，其功能基因組、蛋白組和代謝組學(xué)的研究已取得了一定的進(jìn)展，有關(guān)其分類學(xué)鑒定、抗菌物質(zhì)、抗菌機(jī)制以及與植物互作、食品領(lǐng)域和動(dòng)物領(lǐng)域的應(yīng)用等方面的研究亦較多[18-25]。本研究主要目的是摸清蒼山大蒜貯藏期鱗莖發(fā)病的原因和病原物的種類、致病性及其侵染機(jī)制，為大蒜病害的防治提供技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。在本研究的基礎(chǔ)上，有望在不遠(yuǎn)的將來(lái)開(kāi)發(fā)出能夠有效控制大蒜儲(chǔ)藏期病原菌解淀粉芽孢桿菌的防控技術(shù)。

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