基于電化學(xué)寡核苷酸傳感器的痕量汞離子檢測*

孫嘉弟,甘 穎,梁 韜,王心怡,萬 浩,王 平

(浙江大學(xué)生物傳感器國家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室,生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生儀學(xué)院,杭州 310027)

水是人類生存必不可缺的資源,但近年來國內(nèi)外各類水體的水質(zhì)卻面臨各方面的考驗(yàn),重金屬汞污染就是主要威脅之一。汞以元素汞、無機(jī)汞和有機(jī)汞三種形式存在于自然水體環(huán)境中[1]。工業(yè)汞污染排放以無機(jī)汞為主[2],就算僅有少量汞離子進(jìn)入到血液中,它也極容易與腎細(xì)胞的蛋白質(zhì)牢固結(jié)合并具有抗原性,引起變態(tài)反應(yīng),使得腎功能遭受嚴(yán)重破壞而引起腎病綜合癥[3]。汞離子還能在微生物的轉(zhuǎn)化作用下轉(zhuǎn)變成有機(jī)汞,有機(jī)汞難降解,會(huì)在水生生物體內(nèi)積蓄,通過食物鏈富集進(jìn)入人體后將對(duì)健康造成嚴(yán)重?fù)p害。人體內(nèi)多數(shù)功能性酶均為蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)由氨基酸通過巰基相連組成,而汞能與巰基形成穩(wěn)定的絡(luò)合物而使酶蛋白失活,且還能與羧基、氨基和磷酰基這些功能性基團(tuán)絡(luò)合而破壞其活性,進(jìn)而阻礙細(xì)胞的生物活性及正常代謝,導(dǎo)致各種病變[4]。然而,汞及其化合物由于有很多特殊性能,已被大規(guī)模地應(yīng)用到生產(chǎn)中,我國目前涉及汞的行業(yè)眾多,由此造成的污染范圍非常廣,且有逐步擴(kuò)大的態(tài)勢,我國汞污染問題會(huì)在相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)存在著[5]。因此,在環(huán)境和食品監(jiān)測領(lǐng)域,具有高靈敏度的汞離子檢測方法受到廣泛關(guān)注。

傳統(tǒng)的汞離子檢測手段有原子吸收光譜法(AAS)、原子發(fā)射光譜法(AES)及等離子體電感耦合質(zhì)譜法(ICP-MS)等[6]。AAS的原子吸收帶寬很窄,雖然選擇性較強(qiáng),但對(duì)樣品制作的要求較高,對(duì)復(fù)雜樣品的分析精密度較低,分析時(shí)間較長,對(duì)設(shè)備的要求也高,而且無法同時(shí)分析多種不同的元素[7];AES分析速度快、選擇性好,可同時(shí)分析多種元素,與其他方法的結(jié)合也受到廣泛關(guān)注,但所用設(shè)備昂貴,當(dāng)元素的含量較高時(shí),其分析誤差較大,而當(dāng)元素為超微量級(jí)時(shí),分析的靈敏度又不夠;ICP-MS[8]檢出限低,被公認(rèn)為最強(qiáng)有力的痕量元素分析技術(shù),其檢測范圍寬,靈敏度高,還可進(jìn)行多元素分析,但是由于檢測過程中需要將樣品汽化,這就要求樣品熱敏性低,溶液中懸浮雜質(zhì)要少,即對(duì)待測樣品的要求較高,更主要的是儀器造價(jià)昂貴,且不能進(jìn)行即時(shí)檢測。這些傳統(tǒng)檢測手段所需儀器昂貴而笨重,而且樣品預(yù)處理過程繁瑣,并不適用于現(xiàn)場痕量檢測[9],而另一些新興的方法,如冠醚類汞離子傳感器[10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法及陽極溶出伏安法[11],雖然相對(duì)而言更經(jīng)濟(jì)便捷,但也存在選擇性不高的缺點(diǎn)。

相比以上方法,電化學(xué)傳感器檢出限低,靈敏度高,操作簡便,且易于微型化,方便設(shè)計(jì)成便攜式儀器,是最適合用于現(xiàn)場快速檢測的傳感系統(tǒng),基于寡核苷酸構(gòu)建的電化學(xué)傳感器還具有高度特異性,具有非常廣的應(yīng)用前景。因此本文構(gòu)建了一種基于T-Hg2+-T特異性結(jié)構(gòu)的電化學(xué)寡核苷酸傳感器,利用循環(huán)伏安法(CV)及交流阻抗譜法(EIS)等電化學(xué)分析手段在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下對(duì)溶液中的Hg2+濃度進(jìn)行了定量檢測與分析,通過優(yōu)化固定方式、固定時(shí)間以及固定比例提高了其性能指標(biāo),成功檢測到痕量汞離子,為現(xiàn)場監(jiān)測痕量汞離子提供了一種新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

寡核苷酸鏈5′-S-S-(CH2)6-TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT-3′(T20-SH)購自南京金斯瑞生物科技有限公司。6-巰基-1-己醇(MCH)和三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)購自阿拉丁工業(yè)公司,TE緩沖液購自美國Sigma-aladin公司。汞離子標(biāo)準(zhǔn)液購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái)。配溶液用水均為由Milli-Q純水系統(tǒng)制得的超純水(≥18.3 MΩ)。實(shí)驗(yàn)所用儀器CHI660E電化學(xué)工作站購自上海辰華儀器有限公司,KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器購自昆山超聲儀器有限公司,ThermoFisher離心機(jī)購自上海百基生物科技有限公司。

圖1 電化學(xué)寡核苷酸傳感器檢測Hg2+示意圖

1.2 檢測原理及仿真模型

1.2.1 檢測原理

檢測原理如圖1所示。全T序列寡核苷酸鏈(Oligo)的5′端修飾巰基,可以通過Au-S鍵的共價(jià)鍵合作用自組裝到金電極表面。Oligo結(jié)構(gòu)柔韌,容易彎曲,而且除了Au-S鍵外還可以通過Au-N鍵與金電極結(jié)合,堿基暴露在外側(cè)很容易吸附到金電極的表面,這種非特異性吸附使得單鏈不規(guī)則地平躺在金電極表面。經(jīng)過MCH封閉后,MCH通過競爭Au-S鍵結(jié)合位點(diǎn)來消除非特異性吸附,這種小分子自組裝層保證Oligo能夠保持一致而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)固定在金電極表面。當(dāng)檢測到Hg2+時(shí),Oligo中的胸腺嘧啶與Hg2+特異性結(jié)合后形成一種“發(fā)卡型”結(jié)構(gòu),這種構(gòu)象上的改變?cè)鰪?qiáng)了相鄰鏈間的空間位阻和庫侖力,導(dǎo)致電極表面部分Oligo的釋放[12]。金電極表面的Oligo形態(tài)和密度上的變化能夠引起雙電層電容和電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化,而后者的變化量可以通過交流阻抗譜法來定量測定。樣品Hg2+濃度不同,Oligo形態(tài)和密度變化的程度不同,對(duì)應(yīng)的電化學(xué)指標(biāo)改變量也不同,由此來定量檢測溶液中的汞離子濃度。

1.2.2 仿真模型

對(duì)實(shí)際得到的Nyquist圖構(gòu)建等效電路進(jìn)行仿真。首先構(gòu)建該電池的等效電路,如下圖2電路模型所示。已知圓弧是由RC元件并聯(lián)組成的,且圓弧直徑大小等于生成它的RC元件中電阻R的阻值。放大上述Nyquist圖的高頻部分,在實(shí)際圖線中大圓弧并非與橫軸直接相交得到表征溶液電阻RS的截距,而是在大圓弧之前還存在一個(gè)非常小的半圓弧,表明溶液除阻抗成分外還存在電容成份,因此在RS并聯(lián)C1。實(shí)際中擴(kuò)散層每層的離子濃度都不同,不過每層的阻抗行為等效于RC元件的并聯(lián),為簡化電路,這個(gè)RC元件的無窮集合就用Warburg阻抗W1表示,雙電層的阻抗行為就用RCT、W1和雙電層電容的并聯(lián)來等效。

圖2 仿真模型

1.3 方法與步驟

清洗工作電極:金電極作為自組裝膜的基底,其表面的清潔程度是Oligo自組裝膜形成與否、穩(wěn)定與否的關(guān)鍵。預(yù)處理中先將工作電極在Piranha溶液中浸泡30s,去除電極表面的有機(jī)物。然后在金屬電極專用拋光海綿上依次用1.0 μm,0.3 μm,0.05 μm的氧化鋁粉末研磨拋光,按“8”字形沿順、逆時(shí)針各研磨50圈。再進(jìn)行超聲清洗,依次在無水乙醇和去離子水中超聲5 min。最后進(jìn)行電化學(xué)清洗,將三電極系統(tǒng)浸沒到0.5 mol/L稀硫酸中,進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描直至CV曲線達(dá)到穩(wěn)定且出現(xiàn)較好的金氧化還原峰。取出電極,先用超純水清洗再用氮?dú)獯蹈伞?/p>

配制探針溶液:Oligo凍干粉先經(jīng)12 000 r/min高速離心1 min再用TE緩沖液配成100 μmol/L的Oligo溶液,密閉后充分震蕩混勻。加TCEP斷開二硫鍵:分別取2 μL上述Oligo溶液及100 μmol/L MCH溶液至離心管,各自加入等量100 mmol/L的TCEP,充分震蕩后靜置30 min,防止Oligo及MCH中巰基氧化形成二硫鍵混合物。配制Oligo-MCH-TCEP混合液:取2 μL配好的MCH-TCEP加到Oligo-TCEP混合液中,用0.01 mol/L PBS稀釋,充分震蕩并混勻。

修飾及表征:將金電極表面浸沒到上述Oligo-MCH-TCEP混合液中,在4 ℃的冰箱中靜置8 h。固定完畢后取出金電極,先浸在TE緩沖液中靜置20 min,除去未固定上的Oligo。然后將三電極體系浸沒到16 mL 2 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)混合液中,掃描并記錄金電極經(jīng)過表面修飾后的交流阻抗曲線。

檢測樣品:讓金電極表面完全浸沒在汞標(biāo)準(zhǔn)液中,在室溫下反應(yīng)10 min,用PBS緩沖液清洗后,把三電極體系一起浸沒到16 mL 2 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)中,掃描并記錄交流阻抗曲線。單次檢測結(jié)束后取出金電極,用PBS緩沖液清洗后繼續(xù)與汞標(biāo)準(zhǔn)液反應(yīng),并逐次加大汞標(biāo)準(zhǔn)液濃度,檢測電化學(xué)阻抗的變化。另設(shè)一空白對(duì)照組。

1.4 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

金電極表面Oligo修飾層的有序性、完整性和穩(wěn)定性不僅受到表面清潔度的影響,還與Oligo的固定方式、固定時(shí)間、與MCH的濃度比例等因素相關(guān),為盡可能地提高傳感系統(tǒng)的性能指標(biāo),在保證金電極表面清潔度較理想的前提下,本研究進(jìn)行了系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

固定方式的優(yōu)化:根據(jù)Oligo固定跟MCH封閉這兩個(gè)步驟的前后順序,可把Oligo的固定方式分為預(yù)固定、共固定和后固定三種。預(yù)固定就是在金電極表面先自組裝上Oligo,然后加MCH進(jìn)行封閉,用較強(qiáng)的Au-S鍵取代較弱的Au-N,消除非特異性結(jié)合;共固定是將金電極浸沒在Oligo和MCH的混合溶液中,讓兩者競爭Au-S結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)固定到金電極表面;后固定則是先進(jìn)行MCH封閉,在金電極表面形成小分子自組裝層,再固定上Oligo,讓Oligo的Au-S鍵去取代MCH的Au-S鍵。通過閱讀文獻(xiàn),研究均表明后固定的效果不理想,故本研究著重比較了預(yù)固定和共固定兩者的效果。

固定時(shí)間的優(yōu)化:設(shè)置了固定時(shí)間分別為4 h、8 h、12 h和16 h的四組對(duì)照實(shí)驗(yàn),均采用共固定方式以及1∶1的Oligo和MCH比例,同組PBS緩沖液先后測試8次,用交流阻抗法對(duì)金電極表面Oligo的固定量及穩(wěn)定性進(jìn)行檢測分析。

固定比例的優(yōu)化:實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了三組對(duì)照,混合液中Oligo與MCH的濃度比依次為1∶1、1∶10、1∶100,并用交流阻抗法進(jìn)行了檢測分析。

1.5 特異性實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證構(gòu)建的傳感器對(duì)Hg2+的選擇性,本研究還進(jìn)行了特異性實(shí)驗(yàn),即在相同條件下用這一傳感器檢測其他重金屬離子,對(duì)比檢測效果。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了七組對(duì)照,分別為等體積(100μL)的10 nmol/L Hg2+標(biāo)準(zhǔn)液、1 μmol/L Cu2+標(biāo)準(zhǔn)液、1 μmol/L Cd2+標(biāo)準(zhǔn)液、1 μmol/L Pb2+標(biāo)準(zhǔn)液、1 μmol/L Cr3+標(biāo)準(zhǔn)液、超純水、10 nmol/L Hg2+與1 μmol/L所有其余離子的混合液。

2 結(jié)果與討論

2.1 工作電極表征

如圖3所示,金電極上修飾了Oligo后,在CV圖中其電流明顯減小,在Nyquist圖中其電子轉(zhuǎn)移阻抗大大增加,這是因?yàn)镺ligo雙螺旋骨架上的磷酸基團(tuán)水解后帶負(fù)電,電極表面增加的負(fù)電荷阻礙了電子傳遞,也阻礙了[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-的擴(kuò)散。而經(jīng)過MCH封閉處理之后,金電極的電子轉(zhuǎn)移阻抗略有減小,這是因?yàn)閹в袔€基的MCH能以Au-S鍵與金電極結(jié)合,且Au-S鍵的鍵能大于Au-N鍵,MCH可以取代與金電極非特異性結(jié)合的Oligo。此外,MCH小分子組裝層還可以使得Oligo豎立在金電極表面,修飾層更加有序規(guī)整,電子傳遞和陰離子的擴(kuò)散相對(duì)容易一些。

圖3 金電極修飾前后的表征圖

2.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

兩種固定方式下的阻抗值及其變化率如圖4(a),結(jié)果表明在相同條件下,采用共固定方式固定上的Oligo明顯多于預(yù)固定方式,且檢測完同濃度的汞標(biāo)準(zhǔn)液后,共固定和預(yù)固定的阻抗變化率分別為79%和88%,前者的變化更明顯。重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到了一致的結(jié)果。共固定方式效果更佳可能是因?yàn)楣潭ㄟ^程中Oligo與MCH同時(shí)競爭金電極表面的結(jié)合位點(diǎn)能使自組裝膜更均勻。

圖4 優(yōu)化結(jié)果

如圖4(b),結(jié)合固定量和穩(wěn)定性來分析,固定4 h,雖然金電極表面的電子轉(zhuǎn)移阻抗在固定前后的變化量最大,看似固定量最高但是非常不穩(wěn)定,這可能是因?yàn)? h內(nèi)MCH小分子自組裝層還沒有形成穩(wěn)定,多數(shù)Oligo仍不規(guī)則地平躺在金電極表面,導(dǎo)致固定量“虛高”,且非特性結(jié)合并不穩(wěn)定,檢測時(shí)交流阻抗的波動(dòng)較大。固定8 h后,金電極表面電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化量較小,即修飾層較為穩(wěn)定,此時(shí)MCH小分子自組裝層達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。固定時(shí)間為12 h,金電極表面電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化量又有明顯下降,修飾層穩(wěn)定性也變差,這可能是隨著時(shí)間的加長,有部分Oligo自然地脫落下來。當(dāng)固定時(shí)間再加長到16 h時(shí),金電極表面電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化量略有下降,而且修飾層達(dá)到了非常穩(wěn)定的狀態(tài),此時(shí)電極表面留下結(jié)合最為牢固的Oligo,很少再有脫落。固定時(shí)間為16 h,雖然修飾層的穩(wěn)定性最好,但是電極表面固定上的Oligo太少,能檢測的Hg2+濃度范圍非常有限。而固定時(shí)間為8 h,其固定量與穩(wěn)定性均較為可觀,因此綜合比較之下,選定最佳固定時(shí)間為8 h。

如圖4(c),將阻抗值歸一化后,建立阻抗變化率與汞離子濃度間的線性關(guān)系,發(fā)現(xiàn)阻抗變化率與汞離子濃度的對(duì)數(shù)值間呈線性。比較各固定比例之間的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)Oligo∶MCH=1∶1時(shí),斜率最大,響應(yīng)最靈敏。而當(dāng)Oligo∶MCH=1∶100時(shí),線性范圍、線性度及響應(yīng)靈敏度均不理想,這可能是因?yàn)镸CH濃度過高,過多地競爭到Au-S結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致金電極表面能固定上的Oligo太少。

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

檢測前后阻抗變化率的對(duì)比結(jié)果如圖5所示,傳感器對(duì)10 nmol/L Hg2+標(biāo)準(zhǔn)液和對(duì)所有離子混合液的響應(yīng)近乎一致,即對(duì)混合液的響應(yīng)基本來自Hg2+,而對(duì)1 μmol/L其余金屬離子的響應(yīng)與超純水的近乎一致,這一結(jié)果表明本研究構(gòu)建的傳感器對(duì)Hg2+具有高度選擇性。

圖5 傳感器對(duì)10 nmol/L Hg2+標(biāo)準(zhǔn)液、1 μmol/L 干擾離子、超純水及混合液的響應(yīng)結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)以上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以1∶1的Oligo和MCH濃度比在4 ℃環(huán)境下共固定8 h后構(gòu)建出傳感器,然后用于檢測一系列濃度的汞標(biāo)準(zhǔn)液,繪制對(duì)應(yīng)的Nyquist圖,并進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行Randles電路仿真,計(jì)算每條圖線對(duì)應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移阻抗RCT,分析RCT與汞離子濃度之間的定量關(guān)系。仿真結(jié)果示意圖如圖6所示,可見利用采用的等效電路模型得到仿真結(jié)果與原圖線有較高的吻合度。

圖6 仿真結(jié)果

與不同濃度汞液反應(yīng)后金電極的Nyquist圖如圖7(a)所示,曲線從a到g對(duì)應(yīng)的汞液濃度依次為0.5 nmol/L,3 nmol/L,10 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,500 nmol/L,2 μmol/L。結(jié)果表明當(dāng)用所構(gòu)建的這一傳感器去檢測一系列濃度的汞液時(shí),RCT隨Hg2+濃度的增加依次減小。這是因?yàn)榻痣姌O表面Oligo與Hg2+特異性結(jié)合后形成一種“發(fā)卡型”結(jié)構(gòu),導(dǎo)致相鄰Oligo序列間的空間位阻和庫侖力增強(qiáng),電極表面部分Oligo分子釋放,密度減小,電子傳遞更容易,RCT也因此減小,Hg2+濃度越高結(jié)合得越多,RCT減小越多。

對(duì)阻抗值進(jìn)行歸一化處理,最小二乘法線性擬合后得到如圖7(b)所示阻抗變化率與濃度對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系。本傳感器的線性范圍為0.5 nmol/L～500 nmol/L,檢出限為0.2 nmol/L,且具有較好的重復(fù)性。

(a)檢測一系列濃度梯度汞標(biāo)準(zhǔn)液的Nyquist圖,從a到g對(duì)應(yīng)的汞液濃度依次為0.5 nmol/L,3 nmol/L,10 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,500 nmol/L,2 μmol/L;(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合結(jié)果圖7 檢測結(jié)果圖

2.5 回收率檢測

為了評(píng)估所構(gòu)建的這一傳感器的適用性和可靠性,我們對(duì)飲用水進(jìn)行了檢測,飲用水本底背景檢測結(jié)果如表1所示,由于飲用水中汞含量極低,利用ICP-MS也無法測得,于是我們檢測了實(shí)際水樣加入不同濃度Hg2+后的回收率,結(jié)果如下表2所示,加標(biāo)濃度為0.5 nmol/L、1 nmol/L和5 nmol/L,其回收率分別為92%、125%和97%。以上結(jié)果表明,我們所構(gòu)建的這種傳感器用于檢測飲用水中的微量汞離子時(shí)有較為令人滿意的結(jié)果。

表1 飲用水加標(biāo)前后的離子濃度ICP-MS測定結(jié)果

表2 飲用水加標(biāo)后的Hg2+回收率

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了一種檢測痕量Hg2+的電化學(xué)寡核苷酸傳感器,通過對(duì)固定方式、固定時(shí)間以及固定比例三方面進(jìn)行優(yōu)化,改善了傳感器的性能,利用最小二乘法線性擬合得到了RCT與Hg2+濃度對(duì)數(shù)值間呈線性相關(guān),線性范圍為0.5 nmol/L～500 nmol/L,檢出限為0.2 nmol/L,特異性實(shí)驗(yàn)也證明該傳感器對(duì)Hg2+具有極高的選擇性,且有較好的重復(fù)性。這一傳感器結(jié)合了寡核苷酸鏈生物傳感器的高度特異性及電化學(xué)分析技術(shù)的準(zhǔn)確性、便捷性,無需繁復(fù)的雜交過程也無需標(biāo)記電活性基團(tuán),減少了操作過程帶來的不明確性,避免了電活性基團(tuán)所帶電荷影響反應(yīng)效果,性能更加穩(wěn)定,同時(shí)起到了簡化操作、改善性能和節(jié)省成本的作用。

隨著納米電極日漸成熟,本研究有望通過納米電極來進(jìn)一步降低檢出限。實(shí)際水樣中往往含有多種重金屬離子,這些重金屬離子都是對(duì)人體健康的巨大威脅,若能同時(shí)有效地檢測出多種重金屬離子,這將是對(duì)本項(xiàng)研究實(shí)用性的重大提升。此外,在不同形態(tài)的汞中,甲基汞毒性最強(qiáng),但目前測定甲基汞含量的方法主要依賴于大型儀器分析技術(shù),且要與一些樣品前處理與分離技術(shù)聯(lián)用,非常繁瑣復(fù)雜,往后隨著甲基汞離子(CH3Hg+)特異性的寡核苷酸鏈探針的出現(xiàn)與發(fā)展,更多的研究將致力于對(duì)不同汞形態(tài)的選擇性測定。