淚腺良性淋巴上皮病變的病理特點及IgG4和C3的表達△

陳葉青 董志軍 崔秀成 楊新吉

良性淋巴上皮病變(benign lymphoepithelial lesion，BLEL)，亦稱Mikulicz病，是一種以組織中大量淋巴細胞、上皮細胞來源的良性病變[1]。淚腺BLEL的臨床表現(xiàn)主要以雙側(cè)或單側(cè)淚腺彌漫性無痛性腫大、眼瞼腫脹為特征，反復發(fā)作可導致淚腺纖維化，破壞淚腺的正常功能，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。淚腺BLEL確切的發(fā)病機制和始動因素尚不明確，國內(nèi)外學者提出的主要假說有上皮肌上皮島假說、病毒誘導假說、自身免疫功能障礙假說、性激素紊亂假說、蛋白紊亂假說、IgG4浸潤假說等[3]，但均不能闡述其確切的發(fā)病機制。隨著對該病深入研究，目前認為該病可能是一種IgG4相關性疾病。本研究擬觀察淚腺BLEL的組織病理學變化及IgG4、C3在淚腺BLEL患者淚腺組織中的表達，探討淚腺BLEL的病理特點及其可能的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2010年7月至2018年5月在承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科及解放軍總醫(yī)院眼科就診并手術切除經(jīng)病理檢查確診為淚腺BLEL的患者共15例15眼(試驗組)，其中男9例、女6例，所有患者術前均未接受化學藥物治療和免疫治療，年齡為41～71(56.80±9.26)歲。另外，選取2010年7月至2018年5月于解放軍總醫(yī)院眼科因其他疾病而行眶內(nèi)容物摘除術患者的正常淚腺組織，未被病變侵及或有原發(fā)病的患者10例10眼作為對照組。入選標準：病變與淚腺無相關性，影像學、術中所見及術后病理均證實淚腺結(jié)構(gòu)正常，其中男3例、女7例，年齡為12～65(46.50±18.05)歲。2組患者年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

納入及排除標準參考文獻[4]。BLEL的診斷標準：(1)淚腺對稱性持續(xù)性腫大合并一側(cè)或兩側(cè)頜下腺和(或)腮腺腫大；(2)排除有上述表現(xiàn)的其他疾病，如淋巴瘤、類肉瘤、病毒感染、淋巴增生性疾病等。本研究取得承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院、解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學中心倫理委員會批準，所有患者對本研究知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HE染色觀察淚腺標本組織結(jié)構(gòu)及病理形態(tài)2組患者的手術標本均用中性甲醛固定、石蠟包埋后在病理科存檔，將蠟塊切成厚5 μm的切片，65 ℃溫箱烤片30 min，二甲苯脫蠟2次，每次10 min。梯度酒精脫水各5 min，水洗、高清恒定液、蘇木素染色5 min，流水沖洗2 min，分化液2 s、流水沖洗1 min、返藍液2 min、自來水沖洗2 min、伊紅染液5 min、無水乙醇3次，每次3 min，二甲苯3次、每次3 min，中性樹膠封固。光鏡下拍照淚腺標本組織結(jié)構(gòu)。

1.2.2 免疫組織化學染色觀察淚腺組織中IgG4和C3表達采用免疫組織化學方法檢測2組標本中IgG4、C3的表達水平，一抗為Abcam公司生產(chǎn)的兔抗人C3單克隆抗體[抗C3抗體(EPR19394)，產(chǎn)品編號：ab200999，11000稀釋]和兔抗人IgG4單克隆抗體[抗IgG4抗體(EP4420)，產(chǎn)品編號：ab109493，11000稀釋]，二步法試劑盒為北京中杉金橋生物技術有限公司生產(chǎn)的通用型SPkit快捷免疫組織化學試劑盒(產(chǎn)品編號：SP-9001)。陰性對照：PBS代替一抗。實驗步驟：石蠟塊厚5 μm切片，烤片，二甲苯脫蠟2次，乙醇梯度水化，利用H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，微波爐抗原修復，山羊血清封閉，滴加一抗4 ℃冰箱過夜，生物素標記山羊抗兔IgG的二抗孵育，辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液孵育，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下拍照(×400、×200)。采用Image-Pro Plus軟件計算試驗組及對照組陽性表達面積/HP。判定標準：DAB顯色中IgG4以胞漿染成棕黃色為陽性，C3以胞膜出現(xiàn)棕黃色為陽性。在顯微鏡下觀察每份標本(隨機觀察5個40×10倍視野)，對每個視野陽性面積進行統(tǒng)計后取5個視野陽性表達面積的平均值。

2 結(jié)果

2.1 2組患者淚腺組織病理學HE染色結(jié)果光鏡下檢查可見：對照組淚腺由正常腺泡及導管組成，導管上皮細胞排列整齊，細胞結(jié)構(gòu)清晰，其間有少量的淋巴細胞。試驗組病變的淚腺組織在光鏡下可見淚腺的腺體不同程度萎縮和破壞，大量淋巴細胞及漿細胞浸潤，淋巴濾泡形成，淋巴組織中可見小島狀導管上皮增生結(jié)構(gòu)改變(上皮-肌上皮島)，同時伴有不同程度纖維化(圖1)。

2.2 2組患者淚腺免疫組織化學染色檢測結(jié)果免疫組織化學染色結(jié)果：IgG4免疫球蛋白陽性產(chǎn)物主要位于漿細胞胞漿及部分淋巴細胞胞漿中，呈棕黃色顆粒狀，免疫陽性細胞主要散在分布于淋巴細胞中，IgG4在試驗組中表達[(30 934.80±16 057.17)像素]明顯高于對照組[(325.42±204.43)像素]，差異有統(tǒng)計學意義(t=-7.38，P=0.000)。見圖2。

C3蛋白免疫陽性產(chǎn)物主要位于淋巴細胞的胞膜，呈棕黃色顆粒狀，試驗組中表達[(43 169.49±33 206.60)像素]明顯高于對照組[(323.24±271.29)像素]，差異有統(tǒng)計學意義(t=-5.00，P=0.000)。見圖3。

試驗組中IgG4與C3表達相關分析顯示，二者的表達無相關性(r=-0.137，P=0.671)。

圖1 2組患者淚腺組織HE染色結(jié)果。A：對照組可見淚腺由正常腺泡及導管組成，導管上皮細胞排列整齊，細胞結(jié)構(gòu)清晰，其間有少量的淋巴細胞(HE，×200)；B：試驗組可見淚腺BLEL的淋巴濾泡病理性改變(HE，×100)；C：試驗組可見淚腺BLEL的纖維化病理性改變(HE，×200)。D：試驗組可見淚腺BLEL的萎縮，大量淋巴細胞、漿細胞浸潤(HE，×200)

圖2 2組IgG4陽性產(chǎn)物表達(SP法，×400)。A：試驗組IgG4陽性產(chǎn)物主要位于漿細胞胞漿、部分淋巴細胞胞漿中，呈棕黃色顆粒狀，免疫陽性細胞主要散在分布于淋巴細胞中；B：對照組少量散在分布的IgG4陽性表達產(chǎn)物

圖3 2組C3蛋白免疫陽性產(chǎn)物表達(SP法，×400)。A：試驗組C3蛋白免疫陽性產(chǎn)物主要位于淋巴細胞的胞膜，呈棕黃色顆粒狀；B：對照組C3蛋白免疫陽性產(chǎn)物少量散在分布于淋巴細胞的胞膜，呈棕黃色顆粒狀

3 討論

BLEL是一種以淋巴細胞彌漫性浸潤多個腺體，同時腺體內(nèi)肌導管上皮細胞反應性增生為特征的良性病變[5]，常累及多個器官或組織，淚腺BLEL是一種極具代表性的BLEL。本研究以正常淚腺作為對照組，正常淚腺組織病理學表現(xiàn)為淚腺由腺泡和導管組成，導管上皮細胞排列整齊，細胞結(jié)構(gòu)清晰，其間有少量的淋巴細胞；試驗組淚腺出現(xiàn)不同程度的萎縮、破壞，甚至正常濾泡、導管、細胞結(jié)構(gòu)消失，大量淋巴細胞及漿細胞浸潤，淋巴濾泡、上皮-肌上皮島形成，伴有纖維化，表現(xiàn)出與正常淚腺具有顯著差異的病理形態(tài)學改變。既往的研究只對淚腺BLEL進行病理形態(tài)學描述，無正常淚腺組織病理形態(tài)的對比性觀察，本研究首次將淚腺BLEL同正常淚腺病理形態(tài)學表現(xiàn)同時進行描述，更確切地揭示了淚腺BLEL的發(fā)病機制。

淚腺BLEL的發(fā)病機制至今尚未完全明確，目前有學者認為其可能是一類IgG4相關性疾病[6-7]，而C3介導的補體途徑的激活可能與其發(fā)生發(fā)展密切相關。IgG4相關性疾病是一種由免疫系統(tǒng)介導的系統(tǒng)性、慢性自身免疫性炎性疾病，該病的主要臨床特征是受累器官腫脹、纖維化和硬化，患者血清中IgG4水平顯著增高，受累組織和器官大量淋巴細胞浸潤，形成生發(fā)中心，特別是IgG4陽性漿細胞浸潤突出[8]。在IgG4相關性疾病中，Kakudo等[9-10]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺炎組織病理出現(xiàn)淋巴細胞浸潤、間質(zhì)纖維化、IgG4陽性漿細胞升高等典型改變，并且認為IgG4的高表達與組織病理學改變相關。Yamada等[11]對淚腺BLEL患者外周血進行相關檢測后發(fā)現(xiàn)，無論病變累及的是組織，還是外周血，均存在IgG4陽性多克隆的細胞，可以解釋BLEL作為一種IgG4相關性疾病所呈現(xiàn)的一些臨床表現(xiàn)。既往的研究采用海綿狀血管瘤作為對照組，未見有學者采用正常淚腺組織研究IgG4、C3表達情況的。本研究以正常淚腺作為對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，試驗組病變淚腺中IgG4表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，這同其他學者研究結(jié)果一致[12-14]，這表明 IgG4可能參與了淚腺BLEL的發(fā)生發(fā)展。

補體系統(tǒng)是人體精細調(diào)節(jié)，在激活與滅活之間形成動態(tài)平衡，當出現(xiàn)調(diào)節(jié)異常后，打破這種動態(tài)平衡可造成自身組織損傷。補體系統(tǒng)是人體重要的免疫組成部分，而C3蛋白是補體系統(tǒng)中不僅含量最高，而且在激活補體途徑上起到樞紐作用。正常情況下，多數(shù)補體成分以非活化形態(tài)存在，當宿主遭受感染防御過程中，補體系統(tǒng)起著重要作用，即通過經(jīng)典途徑、旁路途徑、凝集途徑，經(jīng)過一系列蛋白水解級聯(lián)反應形成最終的攻膜復合體，導致靶細胞裂解[15-16]。Li等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，淚腺BLEL與眼眶海綿狀血管瘤患者病變組織進行差異基因篩選，結(jié)果顯示補體受體介導的信號通路表達豐度最高，同時伴有T細胞和B細胞信號通路的上調(diào)以及絲裂原激活蛋白激酶和轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路的下調(diào)。在本研究中，試驗組病變淚腺中C3表達明顯高于對照組正常淚腺，說明在淚腺BLEL中補體系統(tǒng)被激活，提示C3與淚腺BLEL的存在密切相關。值得關注的是，有學者認為IgG4并不通過經(jīng)典途徑激活補體系統(tǒng)，而是通過旁路途徑和部分IgG4具有結(jié)合活化凝集素途徑激活補體系統(tǒng)[19-20]。本研究中，IgG4和C3表達并未見相關性，我們考慮在淚腺BLEL中IgG4并未激活補體系統(tǒng)或者激活補體系統(tǒng)的因素中IgG4只是非主要因素，存在目前未知的因素。

綜上所述，淚腺BLEL發(fā)生了正常結(jié)構(gòu)萎縮，大量淋巴細胞、漿細胞浸潤等組織病理學改變，這可能與IgG4的高表達及補體系統(tǒng)的激活有關，但IgG4與補體系統(tǒng)之間是否存在“交互作用”仍需進一步探討。