基于高通量測序分析西藏北部高寒草甸不同深度土壤線蟲群落分布特征

薛 蓓,侯 磊,薛會英

西藏農(nóng)牧學院,林芝 860000

土壤線蟲是土壤動物中的優(yōu)勢類群,被認為是地球上數(shù)量最大的多細胞生物[1-2]。土壤線蟲有多種食性,其功能(營養(yǎng))結(jié)構(gòu)是土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要決定因素之一,同時也能夠提供土壤腐屑食物網(wǎng)機能方面的信息,土壤線蟲在草地生態(tài)系統(tǒng)中往往被看作是主要的消費者,與草地生產(chǎn)力密切相關(guān)[3-7]。

傳統(tǒng)的形態(tài)學分離鑒定土壤線蟲需要借助顯微鏡分辨,而且鑒定人員需要進行專業(yè)的培訓,耗時耗力[8],例如從單個樣品中分離鑒定100—150個土壤線蟲需要專業(yè)研究人員花費1 h以上[9]。21世紀以來,新一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展日新月異,可直接測序 16S rRNA 基因的 PCR產(chǎn)物,每次分析獲得的基因序列數(shù)以百萬甚至億萬計,不僅通量高,而且能夠同時分析上百個不同的樣品,是解析復雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對豐度的重要工具[10-11]。

目前,高通量技術(shù)在線蟲研究中得到了一定的應用[12],如國外學者對熱帶雨林和北極地區(qū)的線蟲多樣性[13]、地中海灌木叢線蟲多樣性[14]的研究以土壤活線蟲作為一種生物指標,研究分析外來植物在沿海沙丘生態(tài)系統(tǒng)中的侵襲作用[15]、熱帶和溫帶雨林的線蟲空間和生態(tài)模式[16]和熱帶雨林生物多樣性[17]等。國內(nèi)如馮陳晨等對駱駝斯氏副柔線蟲轉(zhuǎn)錄組進行高通量測序及分析[18]。

本文通過Illumina MiSeq測序技術(shù),在 97%的相似水平下對所測得序列進行OUT聚類和生物信息學分析,研究藏北高寒草甸不同土壤深度線蟲群落結(jié)構(gòu)特征,目的是全面了解高寒草甸不同深度土壤線蟲群落多樣性,為進一步研究不同植被不同氣候變化下土壤線蟲群落特點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗地概況

實驗樣地設(shè)置在西藏大學-中國科學院青藏高原研究所那曲生態(tài)環(huán)境綜合觀測研究站內(nèi)(31°31′38″—31°32′02″N,92°04′03″—92°04′16″E),采樣區(qū)域土壤為高山草甸土,其地被植物主要優(yōu)勢種及亞優(yōu)勢種有高山嵩草(Kobresiapygmaea)、矮火絨草(Leontopodiumnanum)、矮生嵩草(K.humilis)、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、釘柱委陵菜(P.saundersiana)、乳白香青(Anaphallislactea)等[19]。

1.2 樣品采集

2017年8月,在實驗場地內(nèi)設(shè)置 3個六邊形樣地(3個重復),樣地面積均為2.5 m×2.5 m,每個六邊形樣地間距大于100 m。2017年8月,采用三點采樣法,分別采集0—5、5—10、10—15、15—20、20—25 cm 5個深度的土層原狀土樣,裝入無菌采樣袋中,放入冰盒內(nèi),于12 h內(nèi)帶回實驗室置于-80℃冰箱內(nèi)保藏備用。將樣品按照不同深度進行樣品編號,0—5 cm的土壤樣品編號為ZBCD1,5—10 cm的土壤樣品編號為ZBCD2,10—15 cm的土壤樣品編號為ZBCD3,15—20 cm的土壤樣品編號為ZBCD4,20—25 cm的土壤樣品編號為ZBCD5。各樣品含水率等理化性質(zhì)見表1。

ZBCD：藏北草地的漢語拼音首字母簡寫；同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示土層間差異顯著(P<0.05)

1.3 DNA 抽提和PCR擴增

根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進行總DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；參考文獻[10],采用NF15′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′和18Sr2bR 5′-TACAAAGGGCAGGGACGTAAT-3′引物,參考文獻[20]進行PCR擴增。

1.4 Illumina Miseq測序

委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺上進行在線分析(www.i-sanger.com)。其他數(shù)據(jù)處理采用SPSS20軟件。測序數(shù)據(jù)比對數(shù)據(jù)庫為NCBI(NT)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及OTU組成分析

測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表2,從表2可以看出通過對藏北草甸土壤不同深度各樣品中線蟲基因測序,5個樣品總計測得原始序列條數(shù)為(182612±4463)條,質(zhì)控序列總數(shù)為(182164±977)條,共產(chǎn)生990個OTU。其中ZBCD2(5—10 cm)樣品中的OTU最多,達到了214個OTU,ZBCD3(10—15 cm)樣品中的OTU最少,僅為157個。

表2 樣品間測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Sequence data statistics of samples in different fermentation processes

同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示土層間差異顯著(P<0.05)

以多樣性指數(shù)為sobs(表征實際觀測到的物種數(shù)目)做稀釋曲線如圖1。從圖1可知,5個樣品的稀釋曲線均基本趨于平緩,說明所得序列可基本反映真實環(huán)境中土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)。

圖1 不同區(qū)組土壤線蟲測序的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil nematodes communities in different soil compartmentsZBCD：藏北草地的漢語拼音首字母簡寫

圖2 不同區(qū)組土壤線蟲群落 OTU韋恩圖Fig.2 OTU Venn diagram of soil nematodes communities in different soil compartments

不同區(qū)組土壤線蟲群落OTU韋恩圖如圖2,共同含有的OTU統(tǒng)計結(jié)果見表2。從圖2可知,5個樣本中共同含135個OTU,其中ZBCD1(0—5 cm)獨有23個OTU,ZBCD2(5—10 cm)獨有21個OTU,ZBCD3(10—15 cm)獨有11個OTU,ZBCD4(15—20 cm)獨有25個OTU,ZBCD5(20—25 cm)獨有28個OTU,分別占總各自O(shè)TU總數(shù)的14.56%、13.46%、7.53%、15.63%和17.18%。

2.2 樣品間Alpha多樣性分析

各樣品中的Alpha多樣性指標如表3。由表3可以看出,不同深度線蟲群落樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計中的Chao1指數(shù)、Ace 指數(shù)差異顯著(P<0.05)；Shannon指數(shù)在ZBCD1和ZBCD5間差異不顯著(P>0.05),而這兩組樣本和其他三組之間Shannon指數(shù)差異顯著(P<0.05)。Shannon值最高的ZBCD2(5—10 cm)樣品除了具有較高的群落多樣性以外,其Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)分別為285.27±17.71和294.47±30.96,具有較高的群落豐富度。

2.3 綱水平各樣本土壤線蟲群落分布圖

綱水平各樣本土壤線蟲群落分布圖如圖3。從圖3可知,在ZBCD1、ZBCD2、ZBCD3、ZBCD4、ZBCD5中刺嘴綱(Enoplea)是優(yōu)勢土壤線蟲群落,分別占到各樣本線蟲群落的72.13%、80.51%、76.79%、54.72%和77.90%；其次為色矛綱(Chromadorea),在ZBCD1、ZBCD2、ZBCD3、ZBCD4、ZBCD5中分別占到各樣本線蟲群落的17.54%、12.04%、12.62%、28.13%和16.92%,位于第3位的是在未分類的線蟲綱(unclassified_p_Nematoda),在ZBCD4中相對含量最高,為17.15%。

2.4 目水平上不同區(qū)組土壤線蟲相對豐度

目水平各樣本土壤線蟲群落分布圖如圖4。從圖4可知,在5個樣本中屬于土壤線蟲的群落目分別是矛線目(Dorylaimida)、墊刃目(Tylenchida)、未分類的線蟲目(unclassified_p_Nematoda)、三矛目(Triplonchida)、小桿目(Rhabdtida)、刺嘴目(Enoplida)和疏毛目(Araeolaimida)這7個目。其中矛線目(Dorylaimida)在5個樣本中含量均較高,其在ZBCD2中的相對豐度最高,含量為79.49%,其在ZBCD4中的相對豐度最低,含量為48.13%；刺嘴目(Enoplida)在ZBCD4中的相對豐度較高,含量分別為22.72%；三矛目(Triplonchida)在ZBCD4和ZBCD5中相對豐度較高,含量分別為6.59%和7.83%。

表3 樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計Table 3 Alpha diversity in different sample

ZBCD：藏北草地的漢語拼音首字母簡寫；同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示土層間差異顯著(P<0.05)

圖3 綱水平上不同區(qū)組土壤線蟲分布圖Fig.3 Frequence of Class level in soil nematode communities from samples

圖4 目水平上不同區(qū)組土壤線蟲差異檢驗柱形圖Fig.4 Frequence of Order level in soil nematode communities from samples

2.5 聚類分析

屬水平的各樣本土壤線蟲群落TOP50熱圖分析見圖5。從圖5樣品間屬水平的聚類關(guān)系可知,ZBCD2和ZBCD3群落組成是最相似的,ZBCD5、ZBCD4、ZBCD1、ZBCD2和ZBCD3群落的組成相似性有一個遞增的趨勢。熱圖中共顯示30 個土壤線蟲屬,分別為Melenchus(劍尾墊刃屬)、Meloidoderita(無對應中文)、Ecphyadophora(突腔唇屬)、Prismatolaimus(棱咽屬)、Tylenchus(墊刃屬)、Clavicaudoides(無對應中文)、Tylencholaimus(墊咽屬)、unclassified_p_Nematoda(未分類的線蟲屬)、Acrobeloides(擬麗突屬)、Paravulvus(無對應中文)、Aphelenchus(滑刃屬)、Odontolaimus(齒咽屬)、Hoplolaimus(紐帶屬)、Paratrichodorus(擬毛刺屬)、Filenchus(絲尾墊刃屬)、Alaimus(無咽屬)、Aphelenchoides(類滑刃屬)、Merlinius(默林屬)、Dorylaimellus(牙咽屬)、Meloidogyna(根結(jié)線蟲屬)、Pratylenchus(短體屬)、Longidorus(長針屬)、Acrobeles(麗突屬)、Aglenchus(野外墊刃屬)、Cylindrolaimus(筒咽屬)、Ditylenchus(莖屬)、Belonolaimus(刺屬)、Proleptonchus(原細齒屬)、Ecumenicus(通俗屬)、Rhabdolaimus(桿咽屬)。Tylencholaimus(墊咽屬)在5 個樣本中相對含量較高,ZBCD5共檢測到30 個屬,ZBCD1、ZBCD2、ZBCD3和ZBCD4分別共檢測到23、24、19、22個屬。

圖5 不同樣品間的土壤線蟲heatmap圖Fig.5 Heatmap of the soil nematodes in different samples Melenchus：劍尾墊刃屬、Meloidoderita：無對應中文、Ecphyadophora：突腔唇屬、Prismatolaimus：棱咽屬、Tylenchus：墊刃屬、Clavicaudoides：無對應中文、Tylencholaimus：墊咽屬、unclassified_p_Nematoda：未分類的線蟲屬、Acrobeloides：擬麗突屬、Paravulvus：無對應中文、Aphelenchus：滑刃屬、Odontolaimus：齒咽屬、Hoplolaimus：紐帶屬、Paratrichodorus：擬毛刺屬、Filenchus：絲尾墊刃屬、Alaimus：無咽屬、Aphelenchoides：類滑刃屬、Merlinius：默林屬、Dorylaimellus：牙咽屬、Meloidogyna：根結(jié)線蟲屬、Pratylenchus：短體屬、Longidorus：長針屬、Acrobeles：麗突屬、Aglenchus：野外墊刃屬、Cylindrolaimus：筒咽屬、Ditylenchus：莖屬、Belonolaimus：刺屬、Proleptonchus：原細齒屬、Ecumenicus：通俗屬、Rhabdolaimus：桿咽屬

2.6 線蟲群落與土壤化學指標的關(guān)系

圖6為不同深度藏北草甸土壤門水平微生物群落與土壤化學指標(表1)關(guān)系,第一主軸和第二主軸對土壤線蟲群落相對豐度方差的解釋比例分別為38.64%和17.18%,兩者共解釋55.82%的方差變化。第一主軸上,K(K+)和HSL(含水率)是主要的影響因子,相關(guān)系數(shù)分別-0.81和-0.97,差異顯著(P<0.05)。第二主軸上,YJZ(有機質(zhì))和Zn(Zn2+)是主要的影響因子,相關(guān)系數(shù)分別為-0.92和-0.91,差異不顯著(P>0.05)。綜上,與不同深度藏北草甸土土壤門水平微生物群落相關(guān)性較大的土壤化學指標是K+、含水率、有機質(zhì)和Zn2+。K+與線蟲門(Nematoda)有較強正相關(guān)性,與子囊菌門(Ascomycota)、環(huán)節(jié)動物門(Annelida)、擬桿菌門(Phragmoplastophyta)和擔子菌門(Basidiomycota)負相關(guān)；含水率與線蟲門(Nematoda)、擬桿菌門(Phragmoplastophyta)和擔子菌門(Basidiomycota)正相關(guān),與子囊菌門(Ascomycota)和環(huán)節(jié)動物門(Annelida)負相關(guān)；有機質(zhì)與線蟲門(Nematoda)、擬桿菌門(Phragmoplastophyta)和擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)正相關(guān),與環(huán)節(jié)動物門(Annelida)負相關(guān)；Zn2+與擬桿菌門(Phragmoplastophyta)和擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)正相關(guān),與環(huán)節(jié)動物門(Annelida)無相關(guān)性,與線蟲門(Nematoda)負相關(guān)。

圖6 門分類水平土壤線蟲群落與土壤化學指標的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of soil nematode phyla and chemical parameters

3 討論與結(jié)論

研究區(qū)域地處青藏高原凍土帶,其草地植被的植物區(qū)系、形態(tài)、生理生化都具有典型的高原特點。凍土能敏感地反映氣候變化,季節(jié)性凍土則因周期性的凍融交替,顯著地影響著土壤生物的種群和群落特征[21]。本研究通過Illumina MiSeq測序技術(shù)鑒定到的藏北高寒草甸(盛長期)(高山嵩草群落)土壤線蟲類群屬數(shù)高于通過傳統(tǒng)鑒定手段得(藏北高山嵩草群落)到2綱6目[21],運用該技術(shù)研究藏北高山嵩草線蟲群落還未見文獻報道。

(1)高通量測序結(jié)果表明藏北高山嵩草(盛長期)5個土壤樣品中的(990±58)個OTU分屬于1個門,3個綱,7個目,25個科,30個屬。刺嘴綱(Enoplea)、色矛綱(Chromadorea)是藏北高山嵩草平均相對豐度最高的綱,其中刺嘴綱(Enoplea)在ZBCD2(5—10 cm)中相對含量最高,達到80.51%,色矛綱(Chromadorea)在ZBCD4(15—20 cm)中對含量最高,達到28.13%。從0—25 cm的5份土壤樣本中共同含有135個OTU,其中ZBCD5(20—25 cm)獨有28個,高于5—20 cm4個樣本中獨有的OUT數(shù)。

(2)不同深度藏北高山嵩草(盛長期)線蟲群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較大的土壤化學指標是K+、含水率、有機質(zhì)和Zn2+。其中K+、含水率、有機質(zhì)與線蟲門(Nematoda)有較強正相關(guān)性,而Zn2+與線蟲門(Nematoda)的呈現(xiàn)較強負相關(guān)性。而線蟲中食細菌性線蟲和食真菌性線蟲所占比例較大,通過分析與土壤中擬桿菌門(Phragmoplastophyta)和擔子菌門(Basidiomycota)呈現(xiàn)一定的負相關(guān)。

藏北地區(qū)地處青藏高原腹地,氣候干寒,是全球氣候變化的敏感地帶,是藏北地區(qū)面積最大、最重要的生態(tài)系統(tǒng),其間廣泛分布的高寒草甸類草地具有典型的區(qū)域代表性,其中高山嵩草群落作為最具代表的植被類型,其區(qū)系、形態(tài)、生理生化能較好的反映氣候環(huán)境變化[3-7]。本研究通過當下熱門的微生物生態(tài)學研究技術(shù)—高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing)研究土壤線蟲。傳統(tǒng)的土壤線蟲研究方法是基于線蟲的直接分離鑒定來分析環(huán)境中的線蟲的群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)關(guān)系的,但傳統(tǒng)的形態(tài)學分離鑒定土壤線蟲需要借助顯微鏡分辨,而且鑒定人員需要進行專業(yè)的培訓,耗時耗力,傳統(tǒng)的分離鑒定手段一直難以讓人們?nèi)媪私猸h(huán)境中線蟲的群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)關(guān)系。21世紀以來,DNA測序技術(shù)取得革命性突破,新一代高通量測序16S rRNA基因極有可能成為一種常規(guī)手段分析土壤微生物的物種多樣性變化規(guī)律,成為土壤質(zhì)量評價的常規(guī)方法。高通量測序法具有分析樣本量多、單個樣品序列通量高的優(yōu)點,高通量測序能夠較為全面和準確的反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[10,22]。

本文是以本課題組在藏北高寒草甸開展了數(shù)年的土壤線蟲群落研究為基礎(chǔ),采用NF15′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′和18Sr2bR 5′-TACAAAGGGCAGGGACGTAAT-3′引物通過Illumina MiSeq測序技術(shù),在97%的相似水平下對所測得序列進行OUT聚類和生物信息學,以獲得土壤線蟲群落在不同深度的分布情況,并試圖將所獲得的結(jié)果與環(huán)境條件(水分含量、化學性質(zhì)等)進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)不同深度土壤線蟲種類及豐度存在一定的差異,為下一步研究不同植被以及不同氣候條件下的土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征提供方法上的有力支持。