豬源腸球菌明膠液化表型與5種毒力基因的檢測分析

李岱霞，朱 娜，蔣逸凡，任 杰，黎滿香

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128)

腸球菌(Enterococcus)是一種廣泛分布于大自然中的革蘭氏陽性菌，在人和動物體內(nèi)，腸球菌主要分布于消化道、口腔以及陰道內(nèi)，是一類非常重要的條件致病菌。其中，糞腸球菌(E.feacalis)是腸球菌中最為常見，感染率最高的菌種，其感染的疾病給多種畜禽帶來危害[1-2]，這些疾病以感染性心內(nèi)膜炎、敗血癥、尿路感染、腦膜炎、菌血癥等為主。糞腸球菌的致病力與其攜帶的毒力因子以及毒力因子是否表達有著重大關(guān)系，主要包括心內(nèi)膜炎抗原(efaA)、聚集物質(zhì)(AS、asal、asa373)、明膠酶(gelE)、膠原蛋白黏附素(ace)、表面蛋白(esp、sprE)、溶血素(cyl)、類金黃色葡萄球菌附屬基因(fsrABC)以及兩個假定相關(guān)的毒力基因EF3314 和EF0591 等。

群體感應(yīng)(Quorum-sensing，tfQS)是指細菌根據(jù)細胞密度變化進行基因表達調(diào)控的一種生理行為。QS 系統(tǒng)能夠啟動菌體中相關(guān)基因的表達(如胞外多糖以及胞外酶的毒力基因)[3]。fsr(Enterococcus faecalis regulator)是糞腸球菌的一種明膠酶內(nèi)酯介導(dǎo)的QS 系統(tǒng)，其fsr基因座的遺傳群體包括：反應(yīng)調(diào)節(jié)子(fsrA)、前肽加工蛋白(fsrB)、組氨酸激酶(fsrC)、明膠酶(gelE)、絲氨酸蛋白酶(sprE)。fsr和gelE均是產(chǎn)生明膠酶所必需的，gelE和sprE基因共同參與宿主的組織損傷，感染試驗表明，fsrABC在gelE和sprE的表達調(diào)控方面起著重要作用，兩者均依賴于fsrABC蛋白的激活[4-5]。不僅如此，fsr 系統(tǒng)與腸球菌的致病性還有著直接的聯(lián)系[6-7]。

gelE 及sprE 是兩種存在于腸球菌表面的蛋白釋放酶，前者可以直接或間接降解宿主細胞的的膠原蛋白或組織蛋白，有利于糞腸球菌及其致病物質(zhì)向宿主組織周圍擴散，進一步加重對各組織的傷害。gelE基因的上游是調(diào)節(jié)因子基因fsr，下游是sprE基因，gelE與sprE基因的完全表達由fsrA、fsrB及fsrC基因編碼的密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，在fsrABC的調(diào)節(jié)下，gelE與sprE在某些方面具有競爭作用，如結(jié)合自溶素等，具有優(yōu)勢的一方更易完全表達并發(fā)揮其生物學(xué)作用。腸球菌作為一種機會性致病菌，判斷其毒力的高低主要依賴于表型試驗[8]，如溶血試驗和明膠試驗等。gelE基因的完全表達對糞腸球菌呈現(xiàn)明膠液化的表型具有一定的作用，gelE液化明膠對糞腸球菌的致病機制具有重要意義，且與腸球菌的致病力有重要的關(guān)系。近年來，許多學(xué)者通過對腸球菌毒力基因的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌較屎腸球菌及其它腸球菌更容易出現(xiàn)明膠液化的現(xiàn)象，其致病性也相對較強，但并不是所有檢測到gelE毒力基因的糞腸球菌均能夠液化明膠[9-10]，國內(nèi)外就這部分明膠液化陰性菌株與gelE基因相關(guān)性報道已有很多，但對與該表型可能有關(guān)的其它基因的研究相對較少。本實驗采用PCR 方法，檢測375 株不同來源的腸球菌分離株的gelE、fsrA、fsrB、fsrC以及sprE這5 種毒力基因，并對這些腸球菌進行了液化明膠試驗，了解不同來源豬腸球菌中毒力基因分布及差異，為腸球菌毒力基因的分子流行病學(xué)及臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌 株 2012 年～2016 年分離自健康豬糞便中的193 株腸球菌，包括糞腸球菌148 株，其它腸球菌45 株；分離自2014 年～2015 年健康豬肛門拭子中的139 株腸球菌，包括糞腸球菌13 株，屎腸球菌(E.faecium) 42 株，其它腸球菌84 株；2014 年～2015 年分離自經(jīng)確診為流行性腹瀉病毒(PEDV)感染病豬肛門拭子中的43 株腸球菌，包括糞腸球菌9株，屎腸球菌29 株，其它腸球菌5 株。以上菌株均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院保存。

1.2 主要試劑 Mix 酶購自天根生化科技(北京)有限公司；DM2000 Plus DNA Marker 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TSB 購自北京蘭伯瑞生物公司；明膠購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 腸球菌5 種毒力基因的擴增 采用水煮法提取分離的腸球菌的DNA，制備PCR 模板，引物序列參照文獻[6]設(shè)計，并由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，PCR 擴增5 種毒力基因的目的片段。 PCR程序如下：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s；按照各毒力基因特異性引物要求的退火溫度設(shè)置，時間為30 s，72 ℃ 40 s；35 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，統(tǒng)計結(jié)果。

1.4 腸球菌的明膠液化試驗 按照TSA 配置方案制成明膠平板，將所有腸球菌分離菌無菌穿刺接種于明膠平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，4 ℃放置2 h后觀察明膠液化的情況并記錄。若發(fā)生明膠液化現(xiàn)象則菌落周圍會出現(xiàn)渾濁明亮的光圈。根據(jù)試驗結(jié)果分析5 種毒力基因與明膠液化表型的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 腸球菌5 種毒力因子基因的檢測結(jié)果 以375株不同來源豬腸球菌DNA 為模板，其中糞腸球菌170 株，屎腸球菌71 株，其它腸球菌134 株，采用特異性引物對5 種毒力基因進PCR 擴增。結(jié)果顯示，gelE、fsrA、fsrB、fsrC以及sprE這5 種毒力相關(guān)基因均能夠檢測到，檢出比例為：gelE(155/375，41.3 %)、sprE(183/375，48.8 %)、fsrA (172/375，45.9 %)、fsrB(191/375，50.9 %)、fsrC(183/375，48.8 %) (表1)。該5 種毒力基因普遍存在于糞腸球菌中，且不同腸球菌之間毒力基因的攜帶率存在極顯著差異(p＜0.01)。

表1 375 株腸球菌分離株毒力基因檢測結(jié)果Table 1 The virulence gene detection of the 375 Enterococcus isolates

2.2 腸球菌5 種毒力基因不同組合統(tǒng)計結(jié)果 對375 株腸球菌5 種毒力基因不同組合檢測結(jié)果進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示31.7 % (119/375)的腸球菌未檢測到任何1 種毒力基因；10.4 % (39/375)的菌株中同時檢測到1 種毒力基因；11.5 % (43/375)的菌株同時檢測到2 種毒力基因；10.4 % (39/375)的菌株同時檢測到3 種毒力基因；6.7 % (25/375 )的菌株同時檢測到4 種毒力基因；29.3 % (110/375)的菌株同時檢測到5 種毒力基因(表2)。表明，不同來源及不同種腸球菌之間所擁有的毒力基因種類及組合方式存在差異，其中糞腸球菌擁有更多的毒力基因組合，是主要的毒力基因攜帶者。

表2 375 株腸球菌分離株毒力基因不同組合檢測情況統(tǒng)計Table 2 Summary of the different combination of virulence genes in 375 Enterococcus isolates

2.3 腸球菌明膠液化試驗結(jié)果 對375 株腸球菌進行明膠液化試驗，結(jié)果顯示來自健康豬新鮮糞便的腸球菌中僅有104 株糞腸球菌能夠分解明膠(104/193)，分離自健康豬肛門拭子的腸球菌中僅1株糞腸球菌能夠液化明膠(1/139)，分離自PED 病豬肛門拭子的腸球菌中僅1 株糞腸球菌能夠液化明膠(1/43) (表3)。比較3 種不同腸球菌的明膠液化試驗結(jié)果顯示，屎腸球菌和其它腸球菌中均未發(fā)生明膠溶解，該表型更容易出現(xiàn)在糞腸球菌中。

表3 375 株腸球菌分離株明膠液化試驗結(jié)果Table 3 The result of gelatin liquefaction test in 375 strains of Enterococcus isolates

2.4 腸球菌gelE基因和明膠液化表型關(guān)系的分析結(jié)果 在193 株分離自健康豬新鮮糞便的腸球菌中，共111 株腸球菌檢測到gelE基因，且全部為糞腸球菌，其中能夠分解明膠的有104 株；139 株分離自健康豬肛門拭子的腸球菌中，僅7 株檢測到gelE，且7 株均是糞腸球菌，其中1 株能夠液化明膠；43株分離自PED 病豬肛門拭子的腸球菌中，僅7 株菌檢測到gelE基因，且全為糞腸球菌，其中僅1 株發(fā)生明膠液化現(xiàn)象。糞腸球菌gelE檢出率比屎腸球菌和其它腸球菌高，且更容易出現(xiàn)明膠液化表型，但并不是所有檢測到gelE基因的糞腸球菌均能夠發(fā)生明膠液化現(xiàn)象，表明存在腸球菌明膠液化的表型與基因型不完全一致的現(xiàn)象。

2.5 腸球菌明膠液化表型與5 種毒力基因關(guān)系的分析結(jié)果 對所有菌株的明膠液化試驗結(jié)果與毒力因子組合檢測結(jié)果統(tǒng)計后顯示，由健康豬新鮮糞便中分離到的193 株腸球菌中，共104 株糞腸球菌能夠分解明膠，且這些菌均檢測到全部5 種毒力基因；由健康豬肛門拭子中分離到的139 株腸球菌中，13 株糞腸球菌僅1 株能夠分解明膠，且該菌也能同時檢測到全部5 種毒力基因；由PED 病豬肛門拭子分離到的43 株腸球菌中，9 株糞腸球菌中僅1 株發(fā)生了明膠分解，且該菌也同時檢測到5 種毒力基因。以糞腸球菌明膠的溶解情況為因變量，5 種毒力基因的分布情況為自變量對此結(jié)果進行卡方檢驗，結(jié)果顯示，兩者之間存在極顯著差異(p＜0.01)，初步表明，糞腸球菌gelE基因及參與gelE 表達的fsrABC、sprE基因?qū)δc球菌明膠液化表型的出現(xiàn)均具有一定促進作用。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，糞腸球菌的各個毒力基因檢出率均高于屎腸球菌及其它腸球菌，檢出率最高的是sprE基因，占糞腸球菌總數(shù)的75.9 %，其次是fsrB，占 75.3 %，其余 3 種毒力基因gelE、fsrA、fsrc的檢出率分別為73.5 %、68.2 %、71.2 %，張肖肖等在不同腸球菌攜帶毒力基因的比較中也發(fā)現(xiàn)不同腸球菌之間攜帶的毒力基因有差異，糞腸球菌毒力基因的攜帶率是腸球菌屬中最高的[11]。分析5種毒力基因的不同組合情況顯示，375 株腸球菌中，同時檢測到5 種毒力基因的共有110 株，其中106株為糞腸球菌，占糞腸球菌總數(shù)的62.4 %，表明糞腸球菌較屎腸球菌及其它腸球菌更易同時檢測到5種毒力基因，與先前的報道相符[12]。這可能與糞腸球菌更易出現(xiàn)致病性從而導(dǎo)致機體的感染有關(guān)。在這110 株腸球菌中，其中109 株腸球菌雖然是從健康豬分離得到，但其在宿主體內(nèi)也可能存在較大的安全隱患。

糞腸球菌的致病性是多因子和多功能協(xié)同作用的結(jié)果，雖然各毒力基因檢出率的高低并不能完全說明其致病性的高低，但通過大量醫(yī)學(xué)臨床對致病腸球菌、共生菌、食物源腸球菌以及環(huán)境腸球菌的研究得出結(jié)論，即擁有更多毒力基因組合的菌株其致病力也相對更強[13]。本實驗結(jié)果顯示，某些健康豬源腸球菌毒力基因組合方式差異較大，有的同時含有這5 種毒力基因，而有的則不含這5 種基因中的任何一種，但卻均未出現(xiàn)臨床感染情況。部分學(xué)者解釋說雖然糞腸球菌中能夠檢測到毒力基因，但并不是所有毒力基因均能夠完全表達，或是毒力基因表達的水平下調(diào)或過低，表達后的組合也不盡相同[14-15]，還可能有其它多種因素如環(huán)境等造成上述結(jié)果。此外，這些來自正常菌群且具有多毒力基因組合的糞腸球菌，一旦其中起關(guān)鍵作用的毒力基因完全發(fā)揮作用，在其它完全表達的毒力因子的協(xié)同作用下，勢必會給動物以及人類的健康帶來威脅，這也提醒我們要防患于未然。

本研究從375 株不同來源腸球菌中，共檢測到155 株gelE 陽性菌株，而其中的106 株腸球菌能夠液化明膠，這與崔成等得出的結(jié)果具有一定相似性[16]。部分腸球菌表型和基因型的不一致，Eaton 等對此的解釋是，在某些條件下gelE基因處于沉默狀態(tài)，調(diào)控gelE基因的幾個操縱子發(fā)生了缺失，或者是沒有完全表達，也或者是檢測的操縱子中的基因不夠，忽略了對表型也很重要的其它基因[17]。同時，該106 株液化明膠的腸球菌均為糞腸球菌，表明糞腸球菌更易出現(xiàn)明膠液化的表型，其表型與基因型一致性較高，這與王送林等的報道一致[18]。經(jīng)統(tǒng)計顯示，含全部5 種毒力基因的糞腸球菌，其液化明膠的機率明顯高于其它毒力基因組合的糞腸球菌(p＜0.01)，gelE基因陽性卻不能液化明膠的糞腸球菌可能缺失fsrABC與sprE中的一種或幾種，據(jù)此初步推測，除gelE基因外，可能還有其它能夠液化明膠的基因，如fsrABC基因以及sprE基因等，其作用可能是調(diào)控gelE完全表達而實現(xiàn)糞腸球菌對明膠的液化，這也在一定程度上驗證了Eaton 的解釋[17]。編碼明膠酶的gelE基因及編碼絲氨酸蛋白酶的sprE基因位于同一個操縱子中，其表達由fsrABC 編碼的密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)[19]。gelE基因能否完全表達對明膠液化表型以及腸球菌致病力起著重要作用。Vinai等推測在fsr 群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下，完全表達的gelE會結(jié)合并激活自溶素，使宿主細胞的膠原蛋白或組織蛋白降解從而表現(xiàn)出明膠液化的表型，并且能夠縮短糞腸球菌的長度促使其向周圍組織擴散[20]；除此之外，gelE還對糞腸球菌表面合成的異常致病蛋白起到清除作用，使其正常致病蛋白在糞腸球菌表明停留并發(fā)揮致病作用。對于這5 種毒力基因之間存在的調(diào)控關(guān)系及其在腸球菌致病過程中的作用機制等，尚待進一步的研究。