黑瑪麗精子包特性及pH和溫度對(duì)其精子活力的影響

李紀(jì)同，楊磊，王晶，王冰，楊威利，李瑞靜，張永忠*

(1. 鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腎臟風(fēng)濕科，鄭州450018； 2. 河南省兒童遺傳代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450018；3. 聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城252059)

黑瑪麗Poecilialatipinna隸屬于鳉形目Cyprinodontiformes花鳉科Poeciliidae花鳉屬Poecilia，為卵胎生熱帶魚(yú)類(lèi)，又名黑摩利，全身漆黑如墨，體型較小。因繁殖周期短、成本低，可作為水族館及家庭飼養(yǎng)的觀賞動(dòng)物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但產(chǎn)量低，長(zhǎng)期供不應(yīng)求。因此，研究黑瑪麗精子的生物學(xué)特性及外界環(huán)境因素對(duì)其精子運(yùn)動(dòng)的影響，可為其人工授精、提高規(guī)?；B(yǎng)殖產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

目前，有關(guān)環(huán)境中pH、溫度、離子成分、滲透壓等因素對(duì)魚(yú)類(lèi)精子運(yùn)動(dòng)活力的研究，在卵生魚(yú)類(lèi)中已有較多報(bào)道，但在卵胎生魚(yú)類(lèi)中較少。研究者以劍尾魚(yú)Xiphophorushelleri(Huangetal.，2004；Dongetal.，2006)和孔雀魚(yú)Poeciliareticulata(Tanaka & Oka，2005；郭明申等，2006)為實(shí)驗(yàn)材料對(duì)其精子的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，但尚未有關(guān)于黑瑪麗精子包特性，以及環(huán)境條件對(duì)其精子運(yùn)動(dòng)活力影響的研究報(bào)道。黑瑪麗為卵胎生，體內(nèi)受精，雌魚(yú)受精后40～70 d就可繁殖，每次可產(chǎn)20～60條仔魚(yú)甚至更多，仔魚(yú)出生后生長(zhǎng)5～6個(gè)月就能進(jìn)行繁殖。黑瑪麗具有精子包結(jié)構(gòu)，精子包在交尾時(shí)隨精液被輸送到雌魚(yú)體內(nèi)，在特定條件下精子包破裂，釋放出游離的精子，精子的激活和運(yùn)動(dòng)規(guī)律等特性與卵生魚(yú)類(lèi)顯著不同。因此，本文就黑瑪麗精子包特性以及pH和溫度對(duì)其精子運(yùn)動(dòng)活力的影響進(jìn)行了初步研究，旨在為黑瑪麗等卵胎生魚(yú)類(lèi)的人工授精，以及生殖生物學(xué)特性等研究提供更豐富的基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

成年黑瑪麗購(gòu)自山東省聊城市魚(yú)友水族館，在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)條件為：魚(yú)缸體積約45 L，缸內(nèi)水溫控制在(26±1) ℃，連續(xù)充氣，設(shè)定光周期為14 h光照∶10 h黑暗，每天更換缸內(nèi)水的1/5左右，每天喂食3次冷凍赤蟲(chóng)Glyceradibranchiata。雄魚(yú)體質(zhì)量為1.51 g±0.47 g，體長(zhǎng)為4.73 cm±0.49 cm。

1.2 精液的收集和特征

成年黑瑪麗于本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行常年飼養(yǎng)，一年四季均可采集精液。選用性成熟雄魚(yú)，用干凈紙巾將魚(yú)體表的水擦凈，再用紙巾將魚(yú)泄殖孔和生殖肢周?chē)粮桑p擠魚(yú)腹部?jī)蓚?cè)擠出精液，用20 μL毛細(xì)玻璃管收集精液，并將其轉(zhuǎn)移到1.5 mL的Eppendorf管內(nèi)，過(guò)程中避免尿液、血液和糞便對(duì)精液的污染。每次實(shí)驗(yàn)所用精液樣本來(lái)自3尾及以上魚(yú)精液的混合。精液為乳白色，充滿(mǎn)著大量的微小顆粒(即精子包)。

1.3 Hank’s平衡鹽溶液及其他溶液的配制

Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)的配制參考Huang等(2004)：NaCl 8.0 g、KCl 0.4 g、CaCl2·2H2O 0.16 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、Na2HPO40.06 g、KH2PO40.06 g、NaHCO30.35 g、C6H12O61.0 g溶于1 000 mL去離子水(Millipore S.A. 67120，Molshem，F(xiàn)rance)中，pH=7.5，滲透壓為300 mOsm/kg，與精液等滲。不同pH溶液的配制：將配制好的HBSS分成7份，分別用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH滴定調(diào)節(jié)到pH分別為5、6、7、8、9和10。所有溶液均用去離子水配制。

1.4 精子包形態(tài)結(jié)構(gòu)和熒光觀察

用毛細(xì)玻璃管收集約8 μL新鮮精液后，立即將其均勻地涂在載玻片上，不蓋蓋玻片在熒光顯微鏡(40×10倍)(BX51，Olympus，日本)下觀察精子包的形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)進(jìn)行熒光觀察并攝影。然后，再用移液器滴加適量的去離子水于載玻片上與精液混合均勻，觀察其形態(tài)變化。

1.5 精子包破裂和精子運(yùn)動(dòng)的觀察

用毛細(xì)玻璃管收集6～8 μL新鮮精液后立即轉(zhuǎn)移到1.5 mL的Eppendorf管內(nèi)，以1∶10的比例與HBSS(pH=7.5)混合制成精子懸浮液(Huangetal.，2004)。然后，再用精子懸浮液和HBSS(pH=7.5)以1∶50的比例在1.5 mL的Eppendorf管內(nèi)混合均勻，后用移液器取出20 μL混合液滴在載玻片上，不蓋蓋玻片在顯微鏡下觀察精子包破裂過(guò)程和精子運(yùn)動(dòng)情況，同時(shí)采集照片。為避免精液在載玻片上時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而影響精子運(yùn)動(dòng)，每隔0.5 h再次將混合均勻的精液用移液器取出20 μL滴在載玻片上另一位置，繼續(xù)觀察精子(Levanduski & Cloud，1988)和平均運(yùn)動(dòng)速率(Wilson-Leedyetal.，2009)等參數(shù)來(lái)衡量精子的運(yùn)動(dòng)活力。(1)精子運(yùn)動(dòng)(向前運(yùn)動(dòng)或曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng))百分?jǐn)?shù)：在同一視野中，運(yùn)動(dòng)精子數(shù)占精子總數(shù)的百分比。記錄向前運(yùn)動(dòng)或曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)精子的百分?jǐn)?shù)，原位振動(dòng)的精子不計(jì)(Paniagua-Chavez & Tiersch，2001)；(2)精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間：從精子包完全破裂、精子全部釋放后開(kāi)始到最終停止運(yùn)動(dòng)(運(yùn)動(dòng)精子<5%時(shí))的時(shí)間(Leach & Montgomerie，2000；Dietrichetal.，2005)；(3)精子運(yùn)動(dòng)速率：精子位移與時(shí)間之比。

1.6 pH對(duì)精子包及精子運(yùn)動(dòng)活力的影響

在室溫(20 ℃)條件下，用pH為5、6、7、8、9和10的HBSS分別與精子懸浮液以1∶50的比例在1.5 mL的Eppendorf管內(nèi)混合均勻，然后立即用移液器取出20 μL混合液滴在載玻片上，不蓋蓋玻片在顯微鏡下觀察在不同pH條件下的精子包破裂過(guò)程以及精子運(yùn)動(dòng)情況，同時(shí)采集照片。為避免精液在載玻片上時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而影響精子運(yùn)動(dòng)，每隔0.5 h再次將混合均勻的精液用移液器取出20 μL滴在載玻片上另一位置，繼續(xù)觀察精子運(yùn)動(dòng)情況。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)獲得精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)和平均運(yùn)動(dòng)速率等參數(shù)來(lái)衡量不同pH對(duì)精子運(yùn)動(dòng)活力的影響。

1.7 低溫及常溫保存后精子運(yùn)動(dòng)情況的觀察

將20 μL精子懸浮液用4 ℃條件下的HBSS(pH=7.5)以1∶50的比例稀釋混勻后，立即用移液器取出20 μL置于載玻片上進(jìn)行觀察(同時(shí)將剩余精子混合液置于4 ℃冰箱)，約5 min精子包開(kāi)始破裂，約12 min全部破裂。之后每隔0.5 h用移液器再次混勻并快速取出20 μL置于載玻片上持續(xù)觀察精子運(yùn)動(dòng)情況。其余實(shí)驗(yàn)均在室溫(20 ℃)條件下操作完成，并進(jìn)行與低溫條件下保存相同時(shí)間的觀察和記錄。所有實(shí)驗(yàn)均由相同操作者完成，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次或以上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)或方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑瑪麗精子包和精子運(yùn)動(dòng)的特征

通過(guò)擠壓腹部，每次從每尾魚(yú)可收集6～8 μL精液，精液呈乳白色，充滿(mǎn)精子包，易沉淀，可能由精子包所致。顯微鏡下可看到精液中含有大量圓形或橢圓形精子包(圖1：A)。用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)精子包具有自發(fā)熒光現(xiàn)象，熒光強(qiáng)度隨觀察時(shí)間逐漸減弱直到消失(約持續(xù)20 s)，精子包經(jīng)藍(lán)色光激發(fā)后綠色熒光減弱，而經(jīng)綠色光激發(fā)后沒(méi)有觀察到精子包的紅色熒光現(xiàn)象，經(jīng)紫外光激發(fā)后精子包呈較暗的藍(lán)灰色(圖2：A～D)。將新鮮精液與去離子水混合，立即在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)精子包形狀有所改變(圖1：B)，有的呈啞鈴形，有的呈長(zhǎng)方形，也有的呈不規(guī)則形，這可能是由于精子包內(nèi)外的滲透壓差造成的，但精子包仍完整，未觀察到精子釋放。

圖1 新鮮精液(A)和與去離子水混合后(B)的精子包外部形態(tài)Fig. 1 The morphology of Poecilia latipinna spermatophore in fresh semen (A) and mixation with deionized water (B)

圖2 黑瑪麗精子包的熒光特性Fig. 2 Fluorescent characters of Poecilia latipinna spermatophore

A. 明場(chǎng)下的精子包，B. 精子包在藍(lán)色激發(fā)光下呈現(xiàn)較弱的綠色熒光，C. 精子包在綠色激發(fā)光下無(wú)紅色熒光現(xiàn)象，D. 精子包在紫外光下呈現(xiàn)較暗的藍(lán)灰色

A. spermatophore under bright field，B. spermatophore showed weak green fluorescence under blue exciting light，C. spermatophore displayed no red fluorescence under green exciting light，D. spermatophore appeared dark steel gray fluorescence under ultraviolet light

黑瑪麗具有精子包結(jié)構(gòu)，其精子運(yùn)動(dòng)與卵生魚(yú)類(lèi)不同。Tanaka和Oka(2005)將孔雀魚(yú)精子包破裂及精子由精子包釋放出的過(guò)程分為3個(gè)階段。但觀察發(fā)現(xiàn)，黑瑪麗精子由精子包釋放出的過(guò)程分為4個(gè)階段：第一階段，精子包完整，精子未被激活；第二階段，精子包未破裂，精子被激活(此時(shí)可觀察到在精子包外周表面有精子頭部在晃動(dòng))；第三階段，精子包開(kāi)始破裂，開(kāi)始有精子釋放；第四階段，精子包完全破裂，精子全部釋放(圖3：A～D)。

精液用HBSS(pH=7.5)稀釋?zhuān)跤s5 min后精子包開(kāi)始破裂(即第三階段)，這時(shí)可觀察到精子陸續(xù)從精子包游離出來(lái)，且運(yùn)動(dòng)速度較快。約12 min后，多數(shù)精子包完全破裂，精子全部釋放(即第四階段結(jié)束)。脫離精子包的精子很快便停止了運(yùn)動(dòng)，但多數(shù)精子尾部仍以較快的速度在原位擺動(dòng)。約經(jīng)過(guò)50 min后，處于HBSS稀釋液中的精子被激活而重新開(kāi)始運(yùn)動(dòng)，并且精子運(yùn)動(dòng)的方式和剛從精子包釋放時(shí)一樣，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中都伴隨鞭毛的擺動(dòng)。

圖3 黑瑪麗精子包的破裂過(guò)程Fig. 3 The breakdown process of Poecilia latipinna spermatophore

A. 第一階段，B. 第二階段，C. 第三階段，D. 第四階段

A. the first stage，B. the second stage，C. the third stage，D. the fourth stage

2.2 pH對(duì)黑瑪麗精子包及精子運(yùn)動(dòng)活力的影響

在室溫(20 ℃)條件下，用不同pH的HBSS分別與精子懸浮液混合，精子包破裂情況不同，精子運(yùn)動(dòng)活力也不一樣。在pH為10的HBSS中沒(méi)有觀察到精子包破裂和精子釋放，將其精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)記為0。當(dāng)精子懸浮液分別用pH為5～9的HBSS稀釋后，均可觀察到精子包破裂和精子運(yùn)動(dòng)。在0～0.2 h內(nèi)為精子包破裂階段，并且在0.2～1 h內(nèi)精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)較小，幾乎為0(圖4)。隨時(shí)間延長(zhǎng)，在pH為6～9的HBSS中，精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)都有先增加后降低的趨勢(shì)(圖4)。但在pH為5的HBSS中，精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)一直較低，幾乎為0。當(dāng)pH為7和8時(shí)，HBSS中精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)在各時(shí)間段(點(diǎn))都是最高的(圖4)，并且兩者的運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)均值之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)pH為7時(shí)，精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間要略長(zhǎng)于pH為8時(shí)，但兩者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。并且pH為7和8時(shí)的精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間都顯著長(zhǎng)于pH為9時(shí)(P<0.05)，而與pH為5、6和10時(shí)的精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖5)。

圖4 pH對(duì)黑瑪麗精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)的影響
Fig.4 The effect of pH on the percentage of motile sperms ofPoecilialatipinna

圖5 pH對(duì)黑瑪麗精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響Fig.5 The effect of pH on the motility span ofPoecilia latipinna sperms

a與b、b與c之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，a與c，以及a、b、c與d之間的差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

There is a significant difference between a and b，b and c (P<0.05)； there is an extreme significant difference between a and c，as well as between a and d，b and d，c and d (P<0.01)

在pH為10的HBSS中，精子包未破裂，精子不運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)速率記為0。在pH為5～9的HBSS中，精子平均運(yùn)動(dòng)速率最大值都位于時(shí)間段5～12 h內(nèi)(圖6)。在pH為7的HBSS中，精子平均運(yùn)動(dòng)速率在大部分時(shí)間段內(nèi)顯著高于在pH為5、6、9和10中的(P<0.05)，而與pH為8中的相比，數(shù)值略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖6)。在不同pH的HBSS中精子平均運(yùn)動(dòng)速率都有先增加后降低的趨勢(shì)(圖6)。

2.3 溫度對(duì)黑瑪麗精子運(yùn)動(dòng)活力的影響

用HBSS(pH=7.5)稀釋精液約12 min后，精子包完全破裂，釋放出的精子暫時(shí)處于休眠狀態(tài)，約經(jīng)過(guò)50 min后，處于HBSS稀釋液中的精子會(huì)被激活。因此，在精子由精子包釋放停止運(yùn)動(dòng)到精子被激活的期間，精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)幾乎為0，隨時(shí)間延長(zhǎng)，精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)逐漸增大。但約12 h后，精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)又開(kāi)始逐漸減小(圖7)。在1～30 h內(nèi)，室溫(20 ℃)條件下的精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)大于在低溫(4 ℃)條件下的，而在30 h后，低溫條件下的則又大于高溫條件下的(圖7)。在不同溫度條件下，精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間不同，處于20 ℃和4 ℃條件下HBSS(pH=7.5)中精子的平均運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別約為39 h和58 h，兩者之間的差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖6 pH對(duì)黑瑪麗精子平均運(yùn)動(dòng)速率的影響Fig.6 The effect of pH on the mean velocity of Poecilia latipinna sperms

精子平均運(yùn)動(dòng)速率(在20 ℃或4 ℃下)都有先加快而后減慢的趨勢(shì)。在1～18 h內(nèi)，保存在 20 ℃ HBSS中的精子平均運(yùn)動(dòng)速率略高于4 ℃條件下的，而在18 h后，情況則正好相反。在20 ℃的最大平均運(yùn)動(dòng)速率為12 μm·s-1(圖8)。

圖7 溫度對(duì)黑瑪麗精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)的影響Fig.7 The effect of temperature on the percentage of motile sperms of Poecilia latipinna

圖8 溫度對(duì)黑瑪麗精子平均運(yùn)動(dòng)速率的影響Fig.8 The effect of temperature on the mean velocity of Poecilia latipinna sperms

3 討論

與體外受精的硬骨魚(yú)類(lèi)相比，體內(nèi)受精的黑瑪麗精子在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特性，及運(yùn)動(dòng)規(guī)律等都有顯著差異。在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面，體外受精的魚(yú)類(lèi)精子頭部近似于球形，線(xiàn)粒體集中分布在頭后部。而體內(nèi)受精的魚(yú)類(lèi)精子頭部為細(xì)長(zhǎng)形，線(xiàn)粒體圍繞尾最前段分布，這與哺乳動(dòng)物有些類(lèi)似(Stoss，1983)。在糖代謝活性等方面，體內(nèi)受精的魚(yú)類(lèi)精子也與哺乳動(dòng)物更為類(lèi)似(Kallman，1975)，這可能與精子持久運(yùn)動(dòng)和能量代謝的特殊需求有關(guān)。體內(nèi)受精的魚(yú)類(lèi)，如劍尾魚(yú)在精子發(fā)生過(guò)程中形成了精子包結(jié)構(gòu)，交配時(shí)雄魚(yú)將精子包傳輸?shù)酱启~(yú)體內(nèi)，并可在雌魚(yú)體內(nèi)儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月，其中的精子一直保持授精能力(Yangetal.，2006)。這可能與精子包特性和精子所處環(huán)境的pH和溫度等因素有重要關(guān)系。

3.1 黑瑪麗的精子包和精子運(yùn)動(dòng)特征

體內(nèi)受精的魚(yú)類(lèi)精子包與節(jié)肢動(dòng)物、有尾兩棲類(lèi)及軟體動(dòng)物等的精莢或精包有所不同。部分體內(nèi)受精魚(yú)類(lèi)，如孔雀魚(yú)精子包是在精子發(fā)生過(guò)程中逐漸形成的，而不是像其他動(dòng)物的精莢或精包那樣在精子發(fā)育(基本)完成后再由其他腺體來(lái)源的物質(zhì)粘接或包裹形成。另外一個(gè)特點(diǎn)是部分體內(nèi)受精魚(yú)類(lèi)精液中的精子包在交配過(guò)程中隨精液一起被輸送到雌性體內(nèi)，而不是像其他動(dòng)物的精莢或精包那樣以固形物的形式靠非液體的機(jī)械作用送到雌性體內(nèi)。在中文文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)到對(duì)體內(nèi)受精魚(yú)類(lèi)精子包的具體闡述，也未見(jiàn)對(duì)其專(zhuān)門(mén)命名。這里對(duì)這一特殊結(jié)構(gòu)及其在適當(dāng)溶液中的破裂過(guò)程作了初步研究，并把其名稱(chēng)初步定為“精子包”，以與其他動(dòng)物的精莢、精包等區(qū)別。

觀察發(fā)現(xiàn)，黑瑪麗的精子包破裂和精子運(yùn)動(dòng)都需要在適當(dāng)稀釋液(或雌性體液)中實(shí)現(xiàn)，用HBSS(pH=7.5)對(duì)黑瑪麗精液進(jìn)行稀釋?zhuān)s5 min后，精子包開(kāi)始破裂，精子從精子包外周各個(gè)方向游離出來(lái)，有的精子頭部還披有精子包膜。精子包中不同部位的精子從精子包釋放的位置和時(shí)間是不同的，可能與精子在精子包內(nèi)的分布有關(guān)，排列在精子包內(nèi)表面的精子先釋放出來(lái)；也可能與精子的質(zhì)量有關(guān)，質(zhì)量較高的精子被激活后運(yùn)動(dòng)活力較強(qiáng)，能夠先于質(zhì)量較低的精子以較快的速度游離出來(lái)。將黑瑪麗精子從精子包中釋放出來(lái)的過(guò)程分為4個(gè)階段，這樣就可以對(duì)精子包從開(kāi)始進(jìn)入稀釋液到精子完全釋放的整個(gè)過(guò)程更好地了解和描述。另外，黑瑪麗精子包的自發(fā)熒光現(xiàn)象和其形態(tài)特征很可能有利于進(jìn)一步對(duì)其性腺的發(fā)育和精子的發(fā)生過(guò)程進(jìn)行組織學(xué)方面的研究。

在黑瑪麗精子包破裂和精子釋放過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一種特殊現(xiàn)象，大多數(shù)精子由精子包釋放后就停止了運(yùn)動(dòng)，只有一些精子的尾部仍在擺動(dòng)，約經(jīng)過(guò)50 min后精子會(huì)再次運(yùn)動(dòng)起來(lái)，幾十小時(shí)后最終又停止了運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象尚未見(jiàn)到有關(guān)報(bào)道。一般說(shuō)來(lái)，體外受精的魚(yú)類(lèi)精子一旦被激活運(yùn)動(dòng)后，精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間很短暫，通常只有幾秒到幾分鐘。但是體內(nèi)受精的魚(yú)類(lèi)精子在HBSS中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間在室溫下可維持1 d，4 ℃下可持續(xù)幾天(Huangetal.，2004；Yang & Tiersch，2009)。不同物種的精子在結(jié)構(gòu)和生理上的差異可能是造成精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間不同的主要原因。體內(nèi)受精的魚(yú)類(lèi)精子在形態(tài)上與哺乳動(dòng)物的精子形態(tài)更加相似，且可以在雌性生殖道的液體中運(yùn)動(dòng)幾十小時(shí)(Yang & Tiersch，2009)。尖嘴魚(yú)Syngnathusabaster精子在水中可以運(yùn)動(dòng)5 min，而在卵巢液中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間可超過(guò)25 min(Dzyubaetal.，2008)。體外受精魚(yú)類(lèi)的精子在水中運(yùn)動(dòng)，而體內(nèi)受精魚(yú)類(lèi)或哺乳動(dòng)物的精子是在生殖道液體內(nèi)運(yùn)動(dòng)，2種魚(yú)類(lèi)精子運(yùn)動(dòng)環(huán)境明顯不同，這可能是導(dǎo)致 2種魚(yú)類(lèi)精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯不同的重要原因。本實(shí)驗(yàn)中黑瑪麗精子從精子包釋放后，由于精子包內(nèi)外的滲透壓、pH、離子成分、營(yíng)養(yǎng)成分等發(fā)生了變化，精子需要在新環(huán)境條件下適應(yīng)后才能被再次激活?；蛘呦癫溉閯?dòng)物的精子獲能過(guò)程那樣，由于在沖破精子包游離出的過(guò)程中精子表面粘上了某種(些)物質(zhì)需要一定時(shí)間去除。也許是精子到達(dá)外界環(huán)境時(shí)需要吸收利用HBSS(pH=7.5)(或雌性體液)中的葡萄糖分解產(chǎn)生ATP，而后才能開(kāi)始真正的前進(jìn)式運(yùn)動(dòng)。精子靜止一段時(shí)間后再次運(yùn)動(dòng)可能對(duì)保證其正常的運(yùn)動(dòng)活力和受精能力具有重要意義。但是，目前尚不清楚在雌魚(yú)體內(nèi)精子是否也靜止一段時(shí)間之后再開(kāi)始運(yùn)動(dòng)。另外，再次運(yùn)動(dòng)的精子和剛從精子包中游離出的精子相比，哪類(lèi)精子更容易讓卵子受精，以及其受精能力有何不同等問(wèn)題也有待進(jìn)一步研究。

3.2 pH對(duì)黑瑪麗精子包和精子運(yùn)動(dòng)活力的影響

當(dāng)pH為5時(shí)，盡管精子包可以破裂，但精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)一直都很低。而pH為10時(shí)，精子包不能破裂。這可能是由于強(qiáng)酸強(qiáng)堿不利于精子包破裂，精子不能被正常釋放出來(lái)。即使能夠被釋放出來(lái)，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液中精子的正常生理過(guò)程也無(wú)法實(shí)現(xiàn)。當(dāng)pH為7～8時(shí)，黑瑪麗精子的運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)、平均運(yùn)動(dòng)速率和運(yùn)動(dòng)時(shí)間都較高(長(zhǎng))，而且在pH為7或8下精子的運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)、平均運(yùn)動(dòng)速率和運(yùn)動(dòng)時(shí)間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明中性至弱堿性環(huán)境最適于黑瑪麗精子運(yùn)動(dòng)。適宜的pH可以增加精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)、提高精子平均運(yùn)動(dòng)速率、延長(zhǎng)精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間。這與對(duì)體外受精的玫瑰無(wú)須鲃Puntiusconchonius精子研究結(jié)果(李紀(jì)同等，2012)相似。另外，虹鱒Oncorhynchusmykiss(Wojtczaketal.，2007)和波斯鱘Persiansturgeon(Alavietal.，2004)等體外受精的魚(yú)類(lèi)精子也是在弱堿性溶液中各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)值最大。

3.3 溫度對(duì)黑瑪麗精子運(yùn)動(dòng)活力的影響

Huang等(2004)報(bào)道了綠劍尾Xiphophorushelleri精子在室溫下的HBSS中能維持運(yùn)動(dòng)24 h，而在4 ℃條件下卻能運(yùn)動(dòng)10 d。本實(shí)驗(yàn)中黑瑪麗精子在低溫(4 ℃)條件下約為58 h，而在室溫(20 ℃)條件下運(yùn)動(dòng)時(shí)間約為39 h。在同一溫度條件下，黑瑪麗和綠劍尾的精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間存在較大差別，可能是由于不同物種的精子運(yùn)動(dòng)特性所致。但本實(shí)驗(yàn)也足以說(shuō)明低溫條件可以顯著延長(zhǎng)黑瑪麗精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，這與前述報(bào)道是一致的。在20 ℃下精子的運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)和平均運(yùn)動(dòng)速率在開(kāi)始一段時(shí)間內(nèi)要顯著高于4 ℃，而后來(lái)又低于4 ℃。這可能是由于在高溫條件下精子的新陳代謝旺盛，線(xiàn)粒體產(chǎn)能較快較多，能量消耗也更快，對(duì)精子的細(xì)微結(jié)構(gòu)及大分子等的損傷也快，因此精子的運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)和平均運(yùn)動(dòng)速率在一段時(shí)間后變得低于低溫環(huán)境條件。Gardiner(1978)報(bào)道了孔雀魚(yú)和海鯽魚(yú)Cymatogasteraggregata的精子能夠代謝細(xì)胞外的葡萄糖，Dong等(2006)報(bào)道在HBSS中加有適量的葡萄糖對(duì)劍尾魚(yú)精子保持較高的運(yùn)動(dòng)活力是必不可少的。本實(shí)驗(yàn)中所用的HBSS稀釋液中也加了葡萄糖，但是黑瑪麗精子在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中對(duì)葡萄糖的利用情況還有待進(jìn)一步的研究。