桂北地區(qū)青錢柳不同時(shí)期活性成分分析

郭 亮，李曉鐵，秦麗鳳

(1.桂林市林業(yè)科學(xué)研究所，廣西 桂林 541004；2.桂林林業(yè)學(xué)校，廣西 桂林 541004)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)又名青錢李，搖錢樹等，為胡桃科青錢柳屬植物，該屬僅包含青錢柳一個(gè)品種，是國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)瀕危植物，同時(shí)也是冰川四世紀(jì)保存下來的珍稀樹種，產(chǎn)地主要分布于我國湖南、安徽、江蘇、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖北、四川、貴州、廣西、廣東和云南南部[1]。桂北地區(qū)屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，氣候溫和，雨量充沛，因此較為適合青錢柳生長。

青錢柳不僅是優(yōu)良的造林樹種和綠化樹種，其活性成分還具有豐富的藥用價(jià)值。近年來隨著對(duì)青錢柳研究的深入，發(fā)現(xiàn)葉片中其含有可溶性多糖、黃酮、皂甙等活性成分。在可溶性多糖研究方面，2001年李磊等利用超聲波萃取手段，從青錢柳葉片中提取了1種多糖復(fù)合物，并通過試驗(yàn)證明該種多糖復(fù)合物具有降血糖的功效[2]；2006年鄧小云等利用小鼠慢性皮下腫芽試驗(yàn)，證明多糖物質(zhì)具有消炎和抗凝血作用[3]。在黃酮類化合物研究方面，2007年蔡文偉等發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有抗癌和抗腫瘤的功效[4]；2003年曹緯國等究研證明黃酮類化合物在治療心腦血管疾病、抗病毒和增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功效方面具有積極作用[5]。皂甙類化合物具有多種重要的生物活性和廣泛的藥理作用，例如抗過敏、消炎、抗病毒、治療白血病等[6]。

青錢柳葉片中活性成分含量隨采摘樹齡和采摘時(shí)間具有一定的變化規(guī)律，本次探究旨在利用對(duì)比試驗(yàn)和方差分析法，探究不同采摘樹齡和采摘時(shí)間下，各組分含量的差異，尋找較為適合的采摘樹齡和采摘時(shí)間，提高青錢柳葉片的利用率，同時(shí)選出優(yōu)良的無性系家系，為后期探究應(yīng)用生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法的選取

1.1 供試樣品及采集地概況

采集地點(diǎn)為桂北地區(qū)，采集樣品為桂林市花坪保護(hù)區(qū)本地?zé)o性系家系，桂北地區(qū)屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，氣候溫和，雨量充沛，平均海拔150 m左右，全年無霜期300 d左右，平均氣溫19 ℃，年平均降雨量 1 900 mm，是我國的青錢柳主產(chǎn)區(qū)之一(見表1)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

葡萄糖(對(duì)照品，Sigma公司)，苯酚(AR，國藥集團(tuán))，濃硫酸(AR，廠家)，青錢柳葉片(廣西桂林)，石油醚(60～90，AR，國藥集團(tuán))，無水乙醇(AR，廣東光華)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品，國藥集團(tuán))，香草醛，冰醋酸，甲醇，正丁醇，人參皂苷(標(biāo)準(zhǔn)品，國藥集團(tuán))。

表1 樣品采摘時(shí)間、地點(diǎn)及采摘樹齡

Tab.1 Sample picking time, place and tree age

樣品編號(hào)Sample number采摘時(shí)間Picking time采摘地點(diǎn)Picking place采摘樹齡/aPicking age/a12017年8月9日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所222017年8月9日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所332017年8月9日桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)442017年8月9日桂林市靈川縣靈田鎮(zhèn)1052017年11月13日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所262017年11月13日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所372017年11月13日桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)482017年11月13日桂林市靈川縣靈田鎮(zhèn)1092018年4月12日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所2102018年4月12日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所3112018年4月12日桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)4122018年4月12日桂林市靈川縣靈田鎮(zhèn)10

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

分光光度計(jì)(UV-1800，島津)，索氏提取器，移液槍(20～200 μL、100～1000 μL、500～5000 μL，德國赫施曼)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青錢柳葉片中可溶性多糖的提取及測(cè)定方法

青錢柳葉片經(jīng)過除雜、干燥、粉碎后，用多功能提取器在60 ℃下石油醚脫脂脫色3 h ，濾去石油醚，室溫晾干后作為提取原料。

用葡萄糖配成50 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于各試管中，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

預(yù)處理后的青錢柳葉片經(jīng)水提、過濾后定容到相應(yīng)體積，取1 mL 濾液加入3 mL 無水乙醇，溶液在 8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上層清液得到沉淀，用蒸餾水溶解沉淀，準(zhǔn)確吸取該溶液50 μL，試管加入500 μL 5%苯酚溶液，混勻后快速加入4.0 mL濃硫酸，振蕩混勻80℃水浴20 min進(jìn)行顯色，在490 nm 下測(cè)定其吸光值，根據(jù)所得回歸曲線方程計(jì)算多糖含量，按以下公式計(jì)算多糖得率:青錢柳葉多糖得率= 濾液中多糖的質(zhì)量/ 青錢柳葉質(zhì)量×100 %。

1.3.2 青錢柳葉片中總黃酮的提取及含量測(cè)定方法

用蘆丁對(duì)照品準(zhǔn)確配制0.147 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL于6只10 mL具塞試管中，加入1 mL 1%的三氯化鋁/甲醇溶液，用甲醇定容，搖勻，放置15 min，制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取5 g，精確到0.0001 g，加入30 mL甲醇回流4 h，過濾，提取3次，合并，定容至100 mL，取50 μL，具塞試管中，加入1 mL 1%的三氯化鋁/甲醇溶液，用甲醇定容，搖勻，放置15 min，于410 nm 波長下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算青錢柳總黃酮的含量。

1.3.3 青錢柳葉片中總皂苷的提取及含量測(cè)定方法

精密稱取人參皂苷16.6 mg，定容至10mL，吸取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL，分別置于具塞試管中，于水浴中揮盡溶劑，冷卻，再加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL和硫酸磺1.0 mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取青錢柳葉片10g，置于250 mL燒瓶中，加乙醚40 mL，水浴回流2h，揮去乙醚的脫脂樣品，再用70%的乙醇溶液30 mL回流至流液無色，乙醚提取液置蒸發(fā)皿中，在水浴上濃縮至干，殘?jiān)铀?0mL使溶解。用50 mL水飽和的正丁醇萃取，重復(fù)萃取4次，合并正丁醇萃取液，用20 mL正丁醇飽合水洗滌。正丁醇溶液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，在水浴上濃縮至干，用甲醇溶解殘?jiān)⑵滢D(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得供試液。

吸取20 μL供試液置于具塞試管中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下的操作測(cè)定吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的總皂甙含量。

1.4 數(shù)據(jù)的處理

每種樣品取3株，混合均勻后進(jìn)行有效成分提取，檢測(cè)的結(jié)果利用SPSS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將采集的樣品送至廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院利用紫外分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 各成分含量檢測(cè)結(jié)果

Tab.2 Test results of each component content

12組樣品中可溶性多糖含量最高的為樣品3(可溶性多糖含量為14.69 mg·g-1)，最低的為樣品12(可溶性多糖含量為10.99 mg·g-1)；樣品5組合檢測(cè)到的總黃酮含量最高，為40.33 mg·g-1；樣品12總黃酮含量最低，為25.01 mg·g-1；樣品5的總皂苷含量最高，為23.15 mg·g-1，最低為樣品12，含量為15.02 mg·g-1。

2.2 結(jié)果分析

利用spss軟件進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)采摘時(shí)間和采摘樹齡對(duì)各成分含量影響的顯著程度，結(jié)果如表3：可溶性多糖中采摘時(shí)間的F=2.557，P=0.157>0.05，差異不顯著，說明不同采摘時(shí)間對(duì)青錢柳葉片中可溶性多糖含量的影響并不顯著，采摘樹齡的F=15.935，P=0.003<0.01，差異極顯著，說明不同采摘樹齡對(duì)青錢柳葉片中可溶性多糖含量的影響極其顯著；總黃酮中采摘時(shí)間的F=68 771.677，P=0.000<0.01，說明采摘時(shí)間對(duì)總黃酮含量具有極顯著的影響；采摘樹齡的F=165.780，P=0.000<0.01，說明采摘樹齡對(duì)總黃酮含量同樣具有極顯著的影響；總皂苷中采摘時(shí)間的F=18.613，P=0.003<0.01，采摘樹齡的F=48.464，P=0.000<0.01，說明采摘時(shí)間和采摘樹齡對(duì)青錢柳葉片中總皂苷的含量都有極顯著的影響。在方差分析中表現(xiàn)為影響顯著和影響極顯著的成分都需要進(jìn)行進(jìn)一步的多重比較分析(見表3)。

表3 采摘樹齡和采摘時(shí)間對(duì)各成分含量影響的方差分析

Tab.3 Variance analysis of the effect of picking age and time on the content of components

表4為采摘時(shí)間的多重比較結(jié)果，從中可見，總黃酮在α=0.05顯著水平下，3個(gè)采摘時(shí)間都在不同列，說明3個(gè)采摘時(shí)間之間存在顯著差異，最高為2017年11月13日；總皂苷在α=0.05顯著水平下3個(gè)采摘時(shí)間分布在不同列，證明這3個(gè)采摘時(shí)間兩兩之間同樣具有顯著差異，且2017年11月13日采摘的總皂苷含量最高。

表4 不同采摘時(shí)間的多重比較(SNK法，α=0.05)

Tab.4 Multiple comparison between different picking time(SNK, α=0.05)

表5為不同采摘樹齡間的多重比較結(jié)果，從中可見，可溶性多糖在α=0.05顯著水平下，樹齡3年、4年、10年不在同一列，3個(gè)水平間存在顯著差異；兩年分別與3年和10年在同一列，說明之間沒有顯著差異；兩年和4年不在同一列，存在顯著差異，最高為4年；總黃酮中4個(gè)采摘樹齡同樣不在同列，說明四個(gè)采摘樹齡之間同樣存在顯著差異，最高為兩年；總皂苷中4個(gè)采摘樹齡同樣分布在不同列，證明這4個(gè)采摘樹齡兩兩之間同樣具有顯著差異，且樹齡為兩年時(shí)采摘的總皂苷含量最高。

表5 不同采摘樹齡的多重比較(SNK法，α=0.05)

Tab.5 Multiple comparison between different picking age(SNK, α=0.05)

3 結(jié)論與討論

本次探究利用方差分析和各個(gè)水平間的多重比較，發(fā)現(xiàn)青錢柳葉片采摘時(shí)間和采摘時(shí)的樹齡，對(duì)可溶性多糖含量，總黃酮含量，總皂苷含量會(huì)有一定影響。其中采摘樹齡對(duì)可溶性多糖含量影響分析中F=15.935，P=0.003<0.01，表現(xiàn)的差異極顯著，而采摘時(shí)間對(duì)可溶性多糖含量影響分析中F=2.557，P=0.157>0.05，差異不顯著，因此樹齡達(dá)到4年時(shí)，可溶性多糖含量較多，如果想提取更多可溶性多糖，建議選擇4年生青錢柳葉片進(jìn)行采集；采摘時(shí)間和采摘樹齡分別對(duì)總黃酮含量影響分析中P=0.000<0.01，表現(xiàn)為影響極其顯著，采摘時(shí)間和采摘樹齡分別對(duì)總皂苷含量影響分析中P值分別為0.003和0.000，均小于0.01，同樣表現(xiàn)為影響極其顯著，因此當(dāng)采摘時(shí)間在11月中旬，采摘樹齡為兩年時(shí)，青錢柳葉片中的總黃酮含量和總皂苷含量較高，如果想獲得更多的皂苷和黃酮，應(yīng)選擇兩年生的青錢柳并在每年的11月中旬進(jìn)行采集。此外探究所選取的桂林市花坪保護(hù)區(qū)本地?zé)o性系家系在可溶性多糖含量、黃酮含量、皂苷含量方面都具有較高的水平，具有很高的培養(yǎng)價(jià)值。

提高青錢柳葉片中活性成分的利用率，一方面是要選擇各組分含量較高的時(shí)期進(jìn)行采摘，另一方面是需要更為合理高效的提取方法，本次探究主要側(cè)重于總結(jié)各組分的采摘時(shí)間，而在提取方法方面，主要采用的是前人較為常見的方法，提取率仍有提高的空間，在今后的探究工作中，將著手探索更為高效便捷的青錢柳活性成分提取方法。