EPC、FMD與膿毒癥患者病情嚴重程度的相關(guān)性研究

陳偉棟 徐嘉 黃振華 古釬林 廖瑾莉 韋秋霞 詹紅

【摘要】目的探討膿毒癥患者外周血循環(huán)內(nèi)皮祖細胞（EPC）數(shù)量及肱動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能（FMD）與病情嚴重程度的相關(guān)性。方法納入膿毒癥患者15例為膿毒癥組，同期住院非膿毒癥患者巧例為非膿毒癥組，以Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，體外誘導(dǎo)分化EPC，利用ac-LDL及Lectin抗體熒光標記法進行雙陽性計數(shù);用彩色多普勒超聲檢查測定2組患者的FMD;以序貫器官功能衰竭估計（SOFA）評分評價患者病情嚴重程度。結(jié)果膿毒癥組患者EPC數(shù)量較非膿毒癥組少（33.9±7.7 vs.45.0±7.4，P<0.05），F(xiàn)MD測定值較低[（6.3±1.2）%VS.（7.7±0.9）%，P<0.05]。EPC數(shù)量與FMD測定值呈正相關(guān)（r_r=0.770，P<0.001）;膿毒癥組患者EPC數(shù)量與SOFA評分呈負相關(guān)（r_s=-0.615、P<0.001），F(xiàn)MD測定值與SOFA評分呈負相關(guān)（r_s=-0.636、P=0.011）。結(jié)論膿毒癥患者外周血循環(huán)EPC數(shù)量及FMD測定值或可作為評估膿毒癥病情嚴重程度的指標。

【關(guān)鍵詞】膿毒癥;內(nèi)皮祖細胞;肱動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能;序貫器官功能衰竭估計評分

膿毒癥是因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，是急診科常見的危重癥之一，發(fā)病率逐年升高，病死率高，救治困難[1-2]。機體發(fā)生膿毒癥時，病原體通過炎癥介質(zhì)、細胞因子等介導(dǎo)而引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷。血管內(nèi)皮功能損傷，一方面，血管舒張、毛細血管滲漏、內(nèi)皮腫脹等導(dǎo)致的炎性介質(zhì)浸潤造成組織、器官微循環(huán)障礙，引發(fā)缺血、缺氧;另一方面，內(nèi)皮細胞直接參與免疫應(yīng)答，引起機體免疫功能下降，組織、器官對抗病原體能力下降，造成器官損傷進一步加重[3-4]。內(nèi)皮祖細胞（EPC）是近年來被發(fā)現(xiàn)的一類具有干細胞潛能的前體細胞，能夠定向分化增殖形成成熟的血管內(nèi)皮細胞，從而起到修復(fù)、再生血管作用。在心血管疾病、腦血管疾病、周圍血管疾病及腫瘤血管新生研究中，均證實了EPC在維持和修復(fù)內(nèi)皮細胞功能、血管新生中扮演重要角色[5]。肱動脈血流介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能（FMD）能反映內(nèi)皮功能紊亂程度，F(xiàn)MD檢測是一種無創(chuàng)、可重復(fù)的檢測血管內(nèi)皮功能的新技術(shù)[6]。在膿毒癥發(fā)病機制中EPC數(shù)量和FMD變化及其作用機制迄今尚未明確。筆者通過測定膿毒癥患者循環(huán)EPC數(shù)量和FMD，就其與膿毒癥病情嚴重程度的相關(guān)性進行初步探討。

對象與方法

一、研究對象

連續(xù)納入2017年10月至2018年3月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科收治的膿毒癥患者15例為膿毒癥組，診斷標準參照2016年拯救膿毒癥運動制定的膿毒癥和膿毒癥休克診斷指南（Sepsis 3.0）[1]。15例中男5例、女10例;同時抽取同期住院的非膿毒癥患者15例作為非膿毒癥組，其中男6例、女9例。所有患者均排除以下情況：①既往有高血壓病、糖尿病、高脂血癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中、腫瘤病史;②孕婦;③年齡小于18歲。2組患者基線資料見表1。本研究由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，人組前所有患者或其家屬均簽署了知情同意書。

二、主要儀器與試劑

紅細胞裂解液、淋巴細胞分離液購于中國碧云天公司，EBM-2培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶購于美國Gibco公司，人纖維黏連蛋白購于康寧公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）、乙酞化低密度蛋白（ac-LDL）一抗和外源凝集素（Lectin）一抗購于美國Sigma公司，4%多聚甲醛購于雷根公司，日立彩色多普勒超聲診斷儀（型號TJ454）。

三、分離外周血單個核細胞及培養(yǎng)EPC

抽取2組患者外周靜脈血15ml，常溫下保存于肝素抗凝管。3h內(nèi)加入等體積PBS稀釋，抽取混合稀釋后的血液緩慢垂直加入等體積淋巴細胞分離液液面，常溫離心，400g×30min、小心吸取中間的白膜層置于15ml離心管，經(jīng)PBS 5ml洗滌2次，加入紅細胞裂解液后充分裂解，常溫離心，400g×10min。棄上清后加入EBM-2培養(yǎng)基，混合后均勻鋪于人纖維蛋白包被的6孔細胞培養(yǎng)板，于5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)第4日換液，第7日置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)[7]。

四、細胞計數(shù)

細胞培養(yǎng)7d后取一部分貼壁細胞在10μg/L的ac-LDL溶液中孵育1h，之后用4%多聚甲醛固定，以10μg/L的Lectin抗體溶液孵育1h，并置于熒光顯微鏡下觀察拍片，貼壁細胞吞噬ac-LDL熒光染色陽性為紅色，Lectin抗體熒光染色陽性為綠色，雙染色陽性即紅色和綠色雙染色細胞為EPC，計算EPC數(shù)量[7]。

五、計算膿毒癥組與非膿毒癥組患者序貫器官功能衰竭估計（SOFA）評分

記錄2組患者循環(huán)血壓、氧合指數(shù)、肌酐、膽紅素、血小板計數(shù)及GCS評分，根據(jù)膿毒癥和膿毒癥休克診斷指南（Sepsis 3.0）進行SOFA評分川。

六、受試者朧動脈FMD測定值

使用日立彩色多普勒超聲診斷儀分別測定2組安靜狀態(tài)下、反應(yīng)性充血時肱動脈內(nèi)徑變化。于右臂肘上2～3cm處探測肱動脈，取其縱切面，調(diào)節(jié)增益直至前后壁內(nèi)膜顯示最清晰，同步在心電波形R波頂點處測量心室舒張末期時前后內(nèi)膜間距作為血管基礎(chǔ)內(nèi)徑。后行反應(yīng)性充血試驗，將血壓計袖帶縛于前臂肘關(guān)節(jié)下2～3cm處，充氣加壓至250mm Hg（1mm Hg=0.133kPa），持續(xù)5min后迅速放氣，于放氣后1min內(nèi)測量朧動脈內(nèi)徑。在測量過程中，超聲探頭始終固定于同一位置，測量同一處血管[8]。取3個心動周期的平均值，計算充血實驗前后差值與基礎(chǔ)內(nèi)徑比值。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布計量資料以x1s表示，2組間比較采用t檢驗;非正態(tài)分布計量資料用中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示，組間比較用秩和檢驗。計數(shù)資料用率（百分比）表示，組間比較用Fisher確切概率法。相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、膿毒癥組與非膿毒癥組EPC數(shù)量和FMD測定值的比較

免疫熒光染色圖例見圖1A～C。比較膿毒癥組與非膿毒癥組EPC數(shù)量和FMD測定值，結(jié)果顯示膿毒癥組EPC數(shù)量為33.9±7.7，較非膿毒癥組45.0±7.4少（t=-3.63，P<0.05），見圖1D;膿毒癥組FMD測定值為（6.3±1.2）%，較非膿毒癥組的（7.7±0.9）%低（t=-4.05，P<0.05），見圖1E。

二、膿毒癥組和非膿毒癥組EPC、FMD與SOFA評分的相關(guān)分析結(jié)果

Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示EPC數(shù)量與FMD測定值呈正相關(guān)（r_s=0.770，P<0.001）。在膿毒癥組中進一步分析，結(jié)果顯示EPC數(shù)量與反映患者病情嚴重程度的SOFA評分呈負相關(guān)（r_s=-0.615，P=0.015）、且FMD測定值與SOFA評分呈負相關(guān)（r_s=-0.636，P=0.011）。

討論

機體發(fā)生膿毒癥時，病原體引起的各種炎癥介質(zhì)及細菌毒素釋放均可造成血管內(nèi)皮損傷，發(fā)生組織滲漏、有效循環(huán)血量減少、組織缺血缺氧加重，嚴重者最后發(fā)展至MODS。既往的研究表明，內(nèi)皮細胞損傷的嚴重程度與膿毒癥患者的預(yù)后直接相關(guān)，內(nèi)皮功能損傷越嚴重的膿毒癥患者預(yù)后越差，病死率越高。血管內(nèi)皮損傷時，作為內(nèi)皮細胞前體細胞的EPC從骨髓到損傷部位進行修復(fù)及新生血管再生，在維持血管內(nèi)皮細胞功能上發(fā)揮著重要作用。我們通過測定EPC的數(shù)量及肱動脈FMD來反映血管內(nèi)皮功能，從而進一步評估膿毒癥患者的病情嚴重程度。

本研究結(jié)果顯示膿毒癥組患者的EPC數(shù)量較非膿毒癥組少，這與既往文獻報道的結(jié)論相一致。Mayr等[9]發(fā)現(xiàn)，將小劑量的內(nèi)毒素注人人體可減少EPC數(shù)量。Zahran等[10]發(fā)現(xiàn)，在兒科膿毒癥患兒中，嚴重膿毒癥患兒EPC數(shù)量更低，EPC數(shù)量高的膿毒癥患兒生存率越高。Fan等[11]發(fā)現(xiàn)， EPC及基質(zhì)細胞生長因子可改善膿毒癥患者預(yù)后。徐喜媛等[12]的動物實驗表明，移植到膿毒癥小鼠體內(nèi)的EPC可成功通過血管進人肺、肝、腎等組織，下調(diào)促炎反應(yīng)程度，提高小鼠的生存率，預(yù)示EPC移植或可改善膿毒癥患者預(yù)后。我們使用經(jīng)典的SOFA評分對膿毒癥患者進行器官損傷的評分，發(fā)現(xiàn)EPC數(shù)量與SOFA評分呈負相關(guān)，提示EPC數(shù)量可以反映膿毒癥患者的病情嚴重程度。嚴重膿毒癥時EPC數(shù)量明顯下降可能與骨髓抑制、EPC損傷破壞、炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)EPC凋亡有關(guān)，具體機制尚未明確[13]。

FMD檢測是一種無創(chuàng)的檢查方法，F(xiàn)MD測定值已被廣泛認可作為血管內(nèi)皮功能的評價指標。本研究中2組患者外周血循環(huán)EPC數(shù)量與FMD測定值呈正相關(guān)，提示EPC數(shù)量可以正向反映患者的血管內(nèi)皮功能，膿毒癥時EPC數(shù)量下降伴隨FMD測定值減低，血管內(nèi)皮功能受損。

我們進行FMD測定值與SOFA評分的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈負相關(guān)，即SOFA評分越高，F(xiàn)MD測定值越低，表明FMD測定值可以用于評價膿毒癥患者的病情嚴重程度。

總之，膿毒癥患者外周血循環(huán)EPC數(shù)量減少，F(xiàn)MD測定值降低，且與SOFA評分呈負相關(guān)，因此可通過無創(chuàng)的方法測定肱動脈FMD及循環(huán)EPC數(shù)量來評估器官損傷程度，預(yù)測病情預(yù)后，為臨床評估膿毒癥病情提供新的檢測手段。EPC或可作為評估膿毒癥嚴重程度新的分子生物學(xué)標志物和重要治療靶點，相關(guān)機制需作進一步探討。

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（收稿日期：2018-12-20）

（本文編輯：洪悅民）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.010

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年項目（81801948）;廣東省自然科學(xué)基金（2016A030313249）;廣州市科技項目（201804010007）

作者單位：510080 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科

通信作者，詹紅，E-mail：zhanhong81@126.com