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    堆型艾美耳球蟲(chóng)ATP酶基因的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)

    2019-07-06 06:11:18閻曉菲韓紅玉
    關(guān)鍵詞:堆型艾美耳球蟲(chóng)

    閻曉菲 ,孔 苗 ,韓紅玉 ,董 輝 ,黃 兵

    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 烏魯木齊830052; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室, 上海 200241)

    雞球蟲(chóng)病是一種或數(shù)種艾美耳球蟲(chóng)寄生于雞消化道上皮細(xì)胞而引起的一種原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)病。在集約化養(yǎng)雞場(chǎng)中發(fā)病率達(dá)50%~70%,甚至80%以上,死亡率20%~30%。全世界每年因雞球蟲(chóng)病造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億英鎊。我國(guó)每年花費(fèi)約20億人民幣進(jìn)行預(yù)防,其中并不包括由雞球蟲(chóng)病的隱性感染造成的間接損失[1-2]。堆型艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria acervulina)有較強(qiáng)致病性,寄生于十二指腸和空腸,在集約化養(yǎng)雞場(chǎng)中流行率最高,對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害僅次于柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E. tenella)[3]。目前防治球蟲(chóng)病主要依賴于抗球蟲(chóng)藥物和活卵囊疫苗,但隨著球蟲(chóng)耐藥性不斷產(chǎn)生,藥物預(yù)防己經(jīng)不能很好的防治球蟲(chóng)病?;盥涯乙呙珉m然已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外上市,但由于免疫效果和安全性問(wèn)題,并未得到廣泛推廣使用[4],因此必須采取新的措施防治雞球蟲(chóng)病。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)構(gòu)建的基因工程疫苗已被證實(shí)可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生長(zhǎng)期的體液免疫和細(xì)胞免疫[5],因此安全有效的基因工程疫苗的研制及應(yīng)用將逐漸成為防治雞球蟲(chóng)病的主要手段。

    生物細(xì)胞內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶除參與主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和ATP合成基本過(guò)程外,在細(xì)胞能動(dòng)性和生長(zhǎng)發(fā)育、受體再循環(huán)、蛋白質(zhì)選擇等方面也有重要作用[6]。多種生物的ATP酶相關(guān)基因克隆、表達(dá)及功能研究均有報(bào)道,如微生物炭疽菌[7]和耐氟菌[8],動(dòng)物三疣梭子蟹[9]和小地老虎[10],植物小麥[11]和向日葵[12]。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ATP酶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)EST序列已有報(bào)道[13],研究人員通過(guò)不同分離株的ATP酶基因遺傳多態(tài)性來(lái)分析抗球蟲(chóng)藥的耐藥性[14]。本研究所獲得的堆型艾美耳球蟲(chóng)基因經(jīng)Blast分析,與陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)的ATP酶同源,命名為堆型艾美耳球蟲(chóng)Na+-K+-ATP酶(E. acervulinaNa+-K+-ATPase,EaNKA)[15],對(duì)其進(jìn)行克隆與表達(dá),為今后進(jìn)一步研究該基因的功能及篩選基因工程疫苗候選分子奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒、菌種及主要試劑 堆型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA文庫(kù)[16]由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存提供;pET32a(+)原核表達(dá)載體和大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存;限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ和T4DNA連接酶購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;2×TaqPCR Master MIX、DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA/蛋白質(zhì)Marker、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

    1.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)堆型艾美耳球蟲(chóng)基因序列[17](GenBank登錄號(hào):EU590120.1),利用Primer Primier5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增Na+-K+-ATP酶基因的特異性引物,并在上、下游引物5'端分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)(下劃線)和相應(yīng)的保護(hù)性堿基。預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段約708 bp,上游引物:5'-CG CGGATCCATGTACGCCCAAGAAGAAGC-3',下游引物5'-CCCAAGCTTTCAATAACGAAGCAGA GAG-3',由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1EaNKA基因的克隆與測(cè)序 以堆型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA文庫(kù)為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為40 μL:2×Taq PCR Master MIX 20 μL,cDNA文庫(kù) 10 μL,ddH2O 8 μL,上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果?;厥债a(chǎn)物按照T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行連接。連接體系為10 μL:ddH2O 4.5 μL、目的DNA片段1.5 μL、pUCM-T 1 μL、10×Ligation Buffer 1 μL、50% PEG 4000 1 μL、T4DNA ligase 1 μL?;靹蚝?℃連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆后擴(kuò)大培養(yǎng),經(jīng)PCR鑒定正確后送生工生物工程上海(股份)有限公司測(cè)序。

    1.2.2EaNKA基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI的在線軟件ORF finder分析獲得的新基因全長(zhǎng)cDNA序列,找出ORF;利用ProtParam工具(http://cn.expasy.org /tools/protparam.html)分析編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì);利用protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸序列的親疏水性;利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和SOPMA分析編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu);利用SingalP在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析編碼蛋白有無(wú)信號(hào)肽;利用TMH服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析編碼蛋白有無(wú)跨膜結(jié)構(gòu);利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)分析編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu);利用PSORTⅡ(http://posrt.nibb.ac.jp/)分析亞細(xì)胞定位;利用北京大學(xué)生物信息學(xué)中心WebLab的Antigenic(http://weblab.cbi.pku.edu.cn/)程序分析其抗原位點(diǎn);利用motif_scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)分析功能結(jié)構(gòu)域;利用Blast進(jìn)行序列比對(duì)。

    1.2.3 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a(+)-EaNKA的構(gòu)建與鑒定 利用BamHⅠ和HindⅢ對(duì)克隆質(zhì)粒TEaNKA和空載體pET32a(+)分別進(jìn)行雙酶切,連接目的基因與空載體膠回收酶切產(chǎn)物,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)-EaNKA,連接體系為10 μL:dd H2O 3 μL、目的基因回收產(chǎn)物3 μL、10×Buffer 2 μL、pET32a(+)回收產(chǎn)物1 μL、T4DNA ligase 1 μL。4℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性克隆至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后,進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)鑒定為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒并用BamHⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定,陽(yáng)性克隆送生工生物工程上海(股份)有限公司測(cè)序,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

    1.2.4 重組質(zhì)粒pET32a(+)-EaNKA的原核表達(dá)及重組蛋白的Western blot分析 將過(guò)夜培養(yǎng)的陽(yáng)性菌液轉(zhuǎn)接震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6~1.0,加IPTG至終濃度為0.9 mmoL/L,并分別在2、4、6、8 h取出500 μL培養(yǎng)物。培養(yǎng)物于室溫、1000×g離心30 s,棄上清,沉淀中加入50 μL 1×loading buffer,混勻后100℃水浴煮10 min,SDS-PAGE檢測(cè)分析。常規(guī)SDS-PAGE后,將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,5%脫脂牛奶4℃封閉過(guò)夜;以大腸桿菌裂解液預(yù)吸收的兔抗堆型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊抗血清(1∶500)為一抗,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶5000)為二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè);最后用DAB試劑盒顯色。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 EaNKA基因的克隆與鑒定以堆型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊 cDNA 文庫(kù)為模板,利用合成的引物PCR擴(kuò)增EaNKA基因ORF片段,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,在708 bp 處有一特異性的條帶,與目的片段大小一致(圖1)。將其回收后與pUCM-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)菌液PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定正確,表明成功擴(kuò)增獲得EaNKA基因含ORF的cDNA片段。

    2.2 EaNKA基因的生物信息學(xué)分析根據(jù)EU590120基因序列的ORF設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得EaNKA基因。測(cè)序拼接后,該基因全長(zhǎng)1157 bp,ORF位于81-788 bp之間,長(zhǎng)708 bp,編碼236個(gè)氨基酸(圖2)。EU590120.1基因全長(zhǎng)754 bp,ORF位于17~508 bp之間,長(zhǎng)492 bp,編碼163個(gè)氨基酸。兩基因序列同源性99%,EaNKA基因序列全長(zhǎng)及ORF片段均長(zhǎng)于EU590120.1基因序列。雖然EaNKA基因的ORF片段比EU590120.1基因的ORF片段多216 bp,但多出的堿基沒(méi)有造成之前氨基酸的改變。這可能是由于該基因在轉(zhuǎn)錄后的剪切過(guò)程中存在多種形式[18],因可變剪接形成了不同的轉(zhuǎn)錄本,推測(cè)可能是屬于多基因家族[19]。

    圖1 EaNKA基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 PCR result of EaNKA gene and analysis of the recombinant plasmids with restriction endonucleases digestion

    生物信息學(xué)分析顯示EaNKA基因編碼蛋白理論分子量為25.43 kDa,理論等電點(diǎn)為7.58,酸性氨基酸總數(shù)(Asp+Glu)18個(gè),堿性氨基酸總數(shù)(Arg+Lys)19個(gè),氨基酸組成較多的有Ala(A)14.0%,Leu (L)9.3%,Ser(S)8.9%,Val(V)8.1%,分子式為C1125H1796N306O324S20,總平均親水性(GRAVY)0.358,半衰期30 h,不穩(wěn)定指數(shù)42.81,高于域值40,在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定,脂肪族指數(shù)96.82。在該基因編碼的氨基酸中,親水性氨基酸分布少于疏水性氨基酸,根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律[20],推測(cè)該蛋白為疏水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析,S平均值<0.5,由此推斷該蛋白不存在信號(hào)肽,不屬于分泌蛋白[21],表明該蛋白可以高效表達(dá)[22]??缒そY(jié)構(gòu)分析表明,該蛋白具有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),91~113氨基酸和128~150氨基酸位于跨膜區(qū)。疏水性分析顯示最大值為3.078,最小值為-1.867,在18-35,49-61,91-113,131-148位之間有很強(qiáng)的疏水性。

    抗原位點(diǎn)分析(表1),主要的抗原表位區(qū)有7個(gè),為N端13-41、91-115、122-150、48-75、163-176、189-203、77-82位點(diǎn),推測(cè)該蛋白具有良好的免疫原性,可能是很好的藥物靶標(biāo)[23]。功能結(jié)構(gòu)域分析顯示(圖2),該蛋白序列有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn),3個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn),4個(gè)N-肉豆蔻?;稽c(diǎn),2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn),1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn),1個(gè)FMRF amide相關(guān)肽家族位點(diǎn)。其中N端糖基化位點(diǎn)與抗原性和免疫原性有關(guān),蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)與介導(dǎo)胞外分泌有關(guān),酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位點(diǎn)與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān),N端豆蔻?;稽c(diǎn)可能與蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體外膜有關(guān),許多跨膜蛋白受體都具有蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)[24]。酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)可能有助于氧化應(yīng)激介導(dǎo)的激活[25],F(xiàn)MRF amide相關(guān)肽家族位點(diǎn)可能是一類(lèi)新型離子受體[26]。PSIPRED分析二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)共有10個(gè)α螺旋,1個(gè)β折疊,PSIPRED分析二級(jí)結(jié)構(gòu)[27](圖3),112個(gè)氨基酸構(gòu)成α-螺旋,占47.46%,48個(gè)氨基酸構(gòu)成延伸鏈,占20.34%,19個(gè)氨基酸構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角,占8.05%,57個(gè)氨基酸構(gòu)成無(wú)規(guī)則卷曲,占24.15%。

    圖2 EaNKA基因的核苷酸序列及其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)功能域分析Fig.2 Nucleotide、predicted amino acid sequences and analysis of the functional motifs of EaNKA gene

    表1 EaNKA編碼蛋白的抗原肽位點(diǎn)分析Table1 Analysis of the antigenic peptides of EaNKA protein

    利用swiss-model進(jìn)行蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)建模,與蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖4)。二、三級(jí)結(jié)主。無(wú)規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體/受體結(jié)合的活性部位,易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象[28],從而影響蛋白質(zhì)的功能。亞細(xì)胞定位分析顯示在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、質(zhì)膜、線粒體、液泡中分別占55.6%、11.1%、11.1%、11.1%、11.1%,因此推測(cè)該基因編碼蛋白可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白受體。朱笠[29]研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型肌張力障礙相關(guān)蛋白質(zhì)torsinA是一種新型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)可能起到類(lèi)似分子伴侶的作用,幫助一些分泌型蛋白質(zhì)的成熟和分泌,或參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。Blast分析顯示該基因編碼的氨基酸與堆型艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶相關(guān)蛋白序列(XP013248919、ACB97673)的相似性最高為100%;與巨型構(gòu)為混合型蛋白,主要以無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈為艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)AT P酶相關(guān)蛋白序列(XP013337038)的相似性為86%;與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶相關(guān)蛋白序列(APY19976)的相似性為87%,因此命名該基因?yàn)槎研桶蓝蛳x(chóng)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶(Eimeria acervulinaNa+-K+-ATPase,EaNKA)。

    圖3 EaNKA基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Analysis of the secondary structure about the EaNKA protein

    ATP酶是一種起源于同一個(gè)祖先和存在于所有生物體內(nèi)的酶系統(tǒng),與離子電化學(xué)梯度之間的能量交換是生命活動(dòng)的基本特征[30],普遍存在于細(xì)胞組織及細(xì)胞器膜上[31],是機(jī)體中離子調(diào)控的重要蛋白酶,通過(guò)建立離子跨膜電化學(xué)梯度并催化ATP水解成ADP而釋放能量,為各種離子的轉(zhuǎn)運(yùn)提供最終的驅(qū)動(dòng)力[32]。Na+-K+-ATP酶活性降低可引起細(xì)胞的離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,能量代謝和物質(zhì)代謝紊亂,以及胞漿內(nèi)Ca+的積聚,導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的異常,甚至細(xì)胞凋亡[33]。研究表明莫能霉素可以影響柔嫩艾美耳球蟲(chóng),從而在胞外殺死球蟲(chóng)[34]跨膜鈉離子作為載體的能力,降低了ATP酶的濃度[34]。通過(guò)改變?nèi)崮郯蓝蛳x(chóng)細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP酶活性,可以降低莫能霉素的敏感性[35]。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合電鏡和熒光免疫技術(shù),研究青蒿素對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體的效果,發(fā)現(xiàn)青蒿素通過(guò)抑制大配子體的肌質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca+-ATP酶(SERCA),從而影響卵囊壁和孢子體形成[36]。以上研究表明,Na+-K+-ATP酶和Ca+-ATP 酶活性改變,可成為判定生物體生理功能改變的重要指標(biāo)。

    2.3 重組質(zhì)粒pET32a(+)-EaNKA的構(gòu)建利用BamHⅠ和Hind Ⅲ對(duì)鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒pUCM-T-EaNKA和空載體pET32a(+)分別進(jìn)行雙酶切,膠回收純化后連接,構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-EaNKA。對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定,結(jié)果顯示均為陽(yáng)性,測(cè)序結(jié)果顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-EaNKA構(gòu)建成功(圖1)。

    2.4 重組蛋白His-EaNKA的原核表達(dá)及Western blot分析重組質(zhì)粒pET32a(+)-EaNKA和空質(zhì)粒pET32a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,經(jīng)0.9 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET32a(+)-EaNKA表達(dá)的重組蛋白分子量約為45 kDa左右,與目的蛋白分子量一致(圖5)。Western blot顯示,大腸桿菌裂解液預(yù)吸收的兔抗堆型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊抗血清,能特異性識(shí)別重組蛋白,在45 kDa處出現(xiàn)1條明顯的條帶,空質(zhì)粒對(duì)照組無(wú)明顯條帶(圖6),表明該基因可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)。

    圖4 EaNKA基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Analysis of the tertiary structure about the EaNKA protein

    圖5 重組質(zhì)粒不同時(shí)相表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expression products of recombinant plasmids

    目前已篩選出一些可用于雞球蟲(chóng)基因工程疫苗研制的候選基因,如柔嫩艾美耳球蟲(chóng)GX3262基因[37]、白細(xì)胞介素2(cSZ-2)基因[38]、MZ5-7基因[39],這些基因構(gòu)建的DNA疫苗免疫雞后能夠有效減輕病變特征,增強(qiáng)宿主免疫力。Zhao等[40]對(duì)堆型艾美耳球蟲(chóng)3-1E基因進(jìn)行克隆表達(dá),Western blot分析表明重組蛋白可以與His-Tag(2A8)小鼠mAb特異性反應(yīng),獲得了具有良好生物活性的蛋白,為開(kāi)發(fā)核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。研究人員克隆堆型艾美耳球蟲(chóng)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子,構(gòu)建DNA疫苗,檢測(cè)目的基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染情況,得到有效表達(dá),并能顯著減輕感染雞體重降低和十二指腸損傷[41]。對(duì)堆型艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶(LDH)或LDH與雞IL-2或IFN-γ組合的DNA疫苗進(jìn)行了評(píng)估,證明攜帶LDH抗原基因的DNA疫苗可誘導(dǎo)同源感染的保護(hù)性免疫,其作用可通過(guò)雞IL-2或IFN-γ的共表達(dá)得到增強(qiáng)[42]。Zhu等[43]以堆型艾美耳球蟲(chóng)子孢子cDNA克隆cSZ-JN2基因,構(gòu)建的重組蛋白疫苗能顯著提高免疫雛雞的平均體重增長(zhǎng)率,降低平均病變比例和卵囊產(chǎn)量,且抗球蟲(chóng)指數(shù)大于165。叢培君[44]構(gòu)建了雞堆型艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶增強(qiáng)型核酸疫苗,并進(jìn)行免疫保護(hù)研究,為探討開(kāi)發(fā)研制新型免疫增強(qiáng)型抗球蟲(chóng)核酸疫苗提供了理論基礎(chǔ)。黃藝華[45]構(gòu)建了雞堆型艾美耳球蟲(chóng)Rhomboid增強(qiáng)型核酸疫苗,為研制抗球蟲(chóng)病疫苗提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究克隆獲得的EaNKA基因蛋白與陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶相關(guān),具有多個(gè)抗原位點(diǎn),并能夠與堆型艾美耳球蟲(chóng)抗血清特異性結(jié)合,具有一定的反應(yīng)原性,為篩選疫苗候選分子提供了科學(xué)依據(jù)。

    圖6 重組蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of recombinant proteins

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