不同吸血時(shí)段蜱糞便蛋白組學(xué)比較分析

楊苗苗，周勇志，曹 杰，龔海燕，張厚雙，周金林

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

蜱和蜱傳播疾病一直是影響公眾健康的重大問題[1]。目前，伴隨常規(guī)滅蜱方法而出現(xiàn)的環(huán)境污染、食品安全和蜱的抗藥性等問題日益彰顯。因此，篩選可行的抗原候選分子，開發(fā)針對(duì)它們的疫苗，已成為控制蜱的重要途徑[2]。蜱的消化與生長(zhǎng)發(fā)育及其繁殖密切相關(guān)，而糞便蛋白成分則是反映蜱消化的重要指標(biāo)。本研究旨在通過LC-MS/MS蛋白組學(xué)方法，分析鐮形扇頭蜱不同吸血時(shí)段糞便中的蛋白質(zhì)成份，進(jìn)一步了解蜱的血液消化特征，篩選可用于蜱疫苗研發(fā)的潛在蛋白質(zhì)抗原[3-5]。

1 材料與方法

1.1 蜱的飼養(yǎng)和糞便的收集將鐮形扇頭蜱成蜱分為3組，每組雌蜱60只、雄蜱30只，分別接種到3只家兔的耳部。接種前將耳朵的兔毛剃掉，并將耳袋套在兔子耳朵上，耳朵的一端與兔耳基部用縫線固定。將蜱放入固定好的耳袋迅速用膠帶封口。兔子常規(guī)飼養(yǎng)，每日檢查耳袋中蜱的吸血情況，采用真空抽吸泵分別收集蜱吸血d4、d8 的糞便，去除兔子皮屑、兔毛及其他雜物，轉(zhuǎn)移至EP管中備用，并做好標(biāo)記。d4 分別標(biāo)記為F4.1、F4.2、F4.3；d8分別標(biāo)記為F8.1、F8.2、F8.3。

1.2 蛋白質(zhì)的定量取適量糞便樣品，分別加入200 μL SDT裂解液，振蕩器勻漿，沸水浴10 min。超聲破碎（100 W，10 次，每次10 s），沸水浴15 min。14 000×g離心 30 min，取上清。BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

1.3 蛋白質(zhì)的 SDS-PAGE分析每組各取20 μg樣品，5∶1 的體積比加入 5×上樣緩沖液，沸水浴 8 min，14 000×g離心 10 min，取上清，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳。電泳條件：恒流，15 mA，電泳時(shí)間60 min。

1.4 蛋白質(zhì)的FASP（ filter-aided sumple preparation，F(xiàn)ASP）酶解分別從每份樣品中稱取150 μg，加入DTT至終濃度為100 mmol/L，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入 200 μL 尿素緩沖液（8 mol/L尿素，150 mmmol/L Tris-HCl，pH8.0）混勻，轉(zhuǎn)入30 kd超濾離心管，12 000×g離心15 min。加入200 μL尿素緩沖液，14 000×g離心15 min，棄濾液。加入100 μL吲哚-3-乙酸溶液（50 mmol/L吲哚-3-乙酸溶液加入到尿素緩沖液中），600 r/min 振蕩1 min，避光室溫30 min，12 000×g離心10 min。加入100 μL尿素緩沖液，12 000×g離心10 min，重復(fù)2次。加入100 μLNH4HCO3緩沖液，12 000×g離心10 min，重復(fù)2次。加入40 μLTrypsin 緩沖液（3 μgTrypsin 加入到4 μLNH4HCO3緩沖液），600 r/min 振蕩1 min，37℃放置16～18 h。換新收集管，12 000×g離心10 min，收集濾液，濾液C18-SD Extraction Disk Cartridge 脫鹽處理，OD280定量。

1.5 酶解產(chǎn)物的 LC-MS/MS分析按照定量結(jié)果各取2 μg酶解后產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS/MS分析，每個(gè)樣品進(jìn)樣1次。采用納升流速 HPLC 液相系統(tǒng) EASY-nLC1000 進(jìn)行分離。液相A液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為 2%)，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱Thermo EASY column SC200 150 μm*100 mm（RP-C 18）以100%的 A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到經(jīng)色譜柱進(jìn)行分離，流速為400 nL/min。相關(guān)液相梯度如下：0～100 min，B液線性梯度從0%到45%；100～108 min，B液線性梯度從45%到100%；108～120 min，B 液維持在100%。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用 Q-Exactive 質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan）進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)：120 min，檢測(cè)方式：正離子，母離子掃描范圍：300～1800 m/z，多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集20個(gè)碎片圖譜（MS2 scan，HCD）。MS1在M/Z 200時(shí)分辨率為70 000，MS2在M/Z200時(shí)分辨率為17 500。

1.6 Maxquant的非標(biāo)記分6個(gè)LC-MS/MS原始文件導(dǎo)入Maxquant 軟件（版本號(hào) 1.3.0.5）進(jìn)行查庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)是肩突硬蜱的基因組和Ixodidae硬蜱屬的所有蛋白（http://www.uniprot.org/），并進(jìn)行非標(biāo)定量分析。

1.7 Perseus 的統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)分析Maxquant所得的查庫(kù)文件使用 Perseus 軟件（1、3、0、4）進(jìn)行分析，并對(duì)吸血d4和d8糞便進(jìn)行差異蛋白分析。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用BCA 法對(duì)樣本蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，結(jié)果顯示，每組樣品的蛋白濃度為0.622～1.006 μg/μL（表1）。

表1 樣品蛋白質(zhì)濃度信息Table 1 Information of sample protein concentration

2.2 SDS-PAGE分析電泳結(jié)果顯示，樣品條帶分離清晰，蛋白提取效果良好。糞便中存在一組復(fù)雜的蛋白質(zhì)，分子量主要集中于20～150 kDa，在略大于25 kDa、50～75 kDa、75 ～100 kDa之間各有一明顯條帶（圖1）。

圖1 吸血后成蜱糞便樣品的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE of samples from tick after sucking blood

2.3 肽段 OD280測(cè)定經(jīng)吸光值OD280測(cè)定計(jì)算，樣品肽段濃度范圍為1.8 ～2.8 μg/mL，具體見表2.

表 2 肽段 OD280 值Table 2 OD280 values of peptide

2.4 蛋白質(zhì)鑒定及定量結(jié)果對(duì)吸血d4、d8蜱糞便蛋白進(jìn)行LC-MS/MS 質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)存在蜱源肽段數(shù)628個(gè)、蛋白質(zhì)總數(shù)196個(gè)；兔源肽段數(shù)6173個(gè)、蛋白質(zhì)總數(shù)659個(gè)。吸血d4、d8的蜱糞便中均被檢測(cè)到的蜱源蛋白189種，僅存在于吸血d4蜱源蛋白1種，僅存在于吸血d8蜱源蛋白6種。吸血d4、d8的蜱糞便中均檢測(cè)到的兔源蛋白626種，僅存在于d4兔源蛋白10種，僅存在于d8兔源蛋白23種。

2.5 蛋白質(zhì)顯著性分析將F8組與F4組分別進(jìn)行表達(dá)差異 T test分析，P＜0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

蛋白質(zhì)鑒定及定量、LC-MS/MS 質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，共鑒定蜱源蛋白196種、兔源蛋白659種[6]。其中吸血d4與吸血d8相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)蜱源差異蛋白（篩選標(biāo)準(zhǔn)Ratio＞ +/-1.2）17種：13種蛋白表達(dá)上調(diào)，4種蛋白表達(dá)下調(diào)。在蜱源蛋白生物學(xué)進(jìn)程分析結(jié)果中，經(jīng)蛋白質(zhì)定量分析最終得到具有統(tǒng)計(jì)意義的蛋白質(zhì)11個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)10個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)1個(gè)（表3）。差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與物質(zhì)的合成及運(yùn)輸，有機(jī)物的代謝，應(yīng)激反應(yīng)，生物過程的調(diào)節(jié)，細(xì)胞發(fā)育，分化細(xì)胞組分的合成，基因表達(dá)等主要過程。

發(fā)現(xiàn)兔源差異蛋白49種：32種蛋白表達(dá)上調(diào)，17種蛋白表達(dá)下調(diào)。對(duì)兔源蛋白生物學(xué)進(jìn)程分析結(jié)果中，經(jīng)蛋白質(zhì)定量分析最終得到具有統(tǒng)計(jì)意義的蛋白質(zhì)16個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)11個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)5個(gè)（表4）。差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與組成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分，核酸的轉(zhuǎn)錄翻譯，物質(zhì)的合成、運(yùn)輸及有機(jī)物的代謝，能量的代謝，抗凝血等主要過程以及作為具有調(diào)節(jié)功能的激素[7]。

3 討論

對(duì)蜱源差異蛋白分析發(fā)現(xiàn)參與生物過程的差異蛋白有6種：6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、?；?CoA合成酶（片段）、無腦回畸形-1同源物、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2 / 3復(fù)合體亞基2, 34 kDa、Rab GDP解離抑制劑、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。甘油醛-3-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、?；?CoA合成酶（片段）、ATP-檸檬酸裂解酶、磷脂酶A2等參與到有機(jī)物代謝過程；無腦回畸形-1同源物、雌性特異性組胺結(jié)合蛋白2在應(yīng)激反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，?；?CoA合成酶（片段）、ATP-檸檬酸裂解酶在生物合成上有重要的作用，肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2 / 3復(fù)合體亞基 2.3 kDa、踝蛋白等蛋白是細(xì)胞骨架的基本組成部分。

對(duì)兔源差異蛋白分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分有6種：兔內(nèi)質(zhì)蛋白、角蛋白、I型細(xì)胞骨架17、Na（+）/H（+）交換調(diào)節(jié)因子NHE-RF1、兔膠原蛋白α-2（I）鏈、兔脂多糖結(jié)合蛋白。兔延伸因子1-2、腺苷酸合成酶同工酶2、兔核心異型組蛋白H2A、兔酪蛋白激酶II的α亞基等參與到核酸的轉(zhuǎn)錄翻譯過程；兔蘋果酸脫氫酶、兔內(nèi)質(zhì)蛋白、皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白在物質(zhì)的合成、運(yùn)輸及有機(jī)物的代謝方面發(fā)揮重要作用；PAPS合酶1、兔組蛋白H2A、腺苷酸合成酶同工酶2、S-（羥甲基）谷胱甘肽脫氫酶、磷酸甘油酸變位酶在能量的代謝中有重要的作用；血小板活化因子乙酰水解酶IB亞基α參與抗凝血過程。

表3 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義蜱源差異蛋白Table 3 Statistically significant difference tick-derived proteins

表4 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義兔源差異蛋白Table 4 Statistically significant difference rabbit-derived proteins

鐮形扇頭蜱雌性成蜱在宿主內(nèi)寄生時(shí)，一般前期為慢速吸血期，6 d后進(jìn)入快速吸血期。根據(jù)蛋白組學(xué)結(jié)果顯示，F(xiàn)8組雌性特異性組胺結(jié)合蛋白2表達(dá)下調(diào)，該蛋白在逃避或抵抗宿主防御反應(yīng)方面發(fā)揮重大作用[8]，這與蜱叮咬誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)時(shí)，蜱會(huì)分泌相應(yīng)物質(zhì)來干擾宿主反應(yīng)這一現(xiàn)象符合。6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、?；?CoA合成酶（片段）、ATP-檸檬酸裂解酶、磷脂酶A2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等與能量產(chǎn)生相關(guān)的酶在F8組中上調(diào)[9]，表明快速飽血期蜱的消化活動(dòng)明顯增強(qiáng)。血紅素脂蛋白具有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，脂質(zhì)通過一些物質(zhì)如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或孔隙定向運(yùn)動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[10-11]。Rab-GDP解離抑制劑作為囊泡運(yùn)輸重要參與者，特異性促進(jìn)囊泡與靶膜上的對(duì)接，進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸途徑[12]。以上三類蛋白在蜱吸血d8糞便中的排出量明顯上升，可能為蜱卵細(xì)胞的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

飽血雌蜱比吸血雌蜱大幾十倍甚至上百倍，蜱進(jìn)入快速飽血期開始快速大量吸取宿主血液，并暫時(shí)存儲(chǔ)于蜱中腸組織。蜱作為一種寄生性節(jié)肢動(dòng)物，宿主血液以胞吞的方式進(jìn)入到蜱消化細(xì)胞進(jìn)行消化分解[13]，在蜱糞便中檢測(cè)到的蛋白是未消化的成分，所以，糞便中某種蛋白含量的上調(diào)從某種程度上意味著蜱對(duì)該蛋白的消化吸收減少。由于蜱吸血d8中腸內(nèi)血液含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于d8，因此一些蛋白消化不完全隨糞便排出。對(duì)下調(diào)蛋白分析可以發(fā)現(xiàn)，兔脂多糖結(jié)合蛋白、兔皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白、S-（羥甲基）谷胱甘肽脫氫酶、膠原蛋白α-2（I）鏈、兔磷酸甘油酸變位酶有明顯下調(diào)，表明蜱在該階段對(duì)其吸收率增高?？紤]到是因?yàn)榇乞缥笃诖罅柯训纳?，這些蛋白在進(jìn)入蜱體內(nèi)可能一部分被消化吸收重新合成為自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供機(jī)體利用（如兔脂多糖結(jié)合蛋白），另一部分直接轉(zhuǎn)化為自身成分發(fā)揮其功能。具體機(jī)制仍待進(jìn)一步探究。

本研究提取蜱不同吸血時(shí)段糞便中存在的蛋白，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行了生物學(xué)分析。盡管獲取的數(shù)據(jù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，但是這些蛋白的探究無疑為蜱消化方面的研究豐富了數(shù)據(jù)，同時(shí)對(duì)雌蜱而言，消化的最重要意義在于繁殖產(chǎn)卵，差異蛋白的功能，為抗蜱研究提供了一個(gè)思路。