盤尾絲蟲ASP1蛋白佐劑活性區(qū)不同標(biāo)簽融合表達(dá)與佐劑活性比較

胡 威，盧會(huì)鵬，張曉凱，李洋洋，張?chǎng)斡睿臅岳?，孫懷昌,2

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州225300）

重組亞單位疫苗安全性好，但免疫原性較差，需與適當(dāng)免疫佐劑配合使用才能取得良好免疫效果。現(xiàn)有免疫佐劑主要有油佐劑和水佐劑，其中油佐劑誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生較慢，應(yīng)激反應(yīng)較大，但抗體維持時(shí)間較長(zhǎng)；水佐劑誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生快，應(yīng)激反應(yīng)較小，但抗體維持時(shí)間較短。這些傳統(tǒng)免疫佐劑一般只能增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答[1]，因此迫切需要研制能誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的新型免疫佐劑。

盤尾絲蟲（Onchocerca volvulus，Ov）第三期幼蟲活化相關(guān)分泌蛋白（activation-associated secreted protein 1，ASP-1）具有很強(qiáng)的免疫佐劑活性[2-3]。將重組Ov-ASP-1與卵清蛋白、人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）或SARS冠狀病毒重組亞單位疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，結(jié)果顯示不僅能促進(jìn)平衡的Th1/Th2抗體應(yīng)答，而且能增強(qiáng)向Th1偏移的細(xì)胞免疫應(yīng)答[4]。將重組Ov-ASP-1與低劑量流感病毒滅活疫苗免疫小鼠，不僅能顯著加強(qiáng)和加速抗體應(yīng)答，還能加強(qiáng)交叉免疫保護(hù)[5]。將Ov-ASP-1的PR-1佐劑活性區(qū)與卵清蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、HIV抗原肽免疫小鼠，不僅能刺激抗原特異抗體產(chǎn)生，而且能刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素和IL-6等細(xì)胞因子[6]。然而這些重組大腸桿菌表達(dá)的Ov-ASP-1均為不溶性包涵體，不僅需要進(jìn)行復(fù)雜的變性/復(fù)性處理，而且需使用價(jià)格較貴的親和層析柱進(jìn)行純化，作為獸用免疫佐劑使用時(shí)受到很大限制。

類彈性蛋白多肽（elastin-like polypeptide，ELP）是根據(jù)體內(nèi)彈性蛋白五肽重復(fù)序列（如VPGXG）合成的多肽聚合物，具有溫度敏感的可逆相變特性，在低于相變溫度下呈可溶狀態(tài)，在高于相變溫度下呈凝聚狀態(tài)，因此其融合蛋白可通過簡(jiǎn)單的相變循環(huán)純化[7-8]。同時(shí)，ELP也具有一定的免疫佐劑作用[9]。ELK16等自聚肽能在細(xì)菌內(nèi)或液體中自動(dòng)聚集成蛋白凝聚物，其融合蛋白可用離心洗滌法純化，純化效率與親和層析法接近[10]。本研究將Ov-ASP-1佐劑活性區(qū)PR-1分別與ELP、ELK16和His標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，與傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）重組VP2蛋白進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，旨在探索不同純化標(biāo)簽對(duì)PR-1免疫佐劑活性的影響，同時(shí)為IBDV新型亞單位疫苗佐劑研制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料ELK16自聚肽和ELP融合表達(dá)載體pETP16P[10]和pET-ELP[8]由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）蛋白酶活性包涵體由本實(shí)驗(yàn)室制備[11]；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GE公司；細(xì)胞因子ELISA試劑盒購(gòu)自武漢酶免生物公司；SPF級(jí)Balb/c小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 重組載體構(gòu)建用網(wǎng)上在線軟件JAVA Codon Adaption Tool，將IBDV VP2基因片段[12]優(yōu)化成大腸桿菌偏愛密碼子序列，5'端引入TEV蛋白酶切位點(diǎn)，序列由上海生工生物公司合成。用限制酶SalI和XhoI將VP2編碼序列插入pET-ELP載體，重組載體命名為ELP-VP2。將上海生工生物公司合成的ASP-1的PR-1功能區(qū)[6]編碼序列分別插入pET-P16P、pETELP和pET-30a載體的SalI/NotI位點(diǎn)，獲得的重組載體命名為pELK-PR1、pELP-PR1和pET-PR1。

1.3 重組蛋白表達(dá)分別將重組質(zhì)粒pELP-VP2、pELK-PR1、pELP-PR1和pET-PR1轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶100比例接種500 mL卡那霉素（50 μg/mL）2×YT培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。4℃、

4000 ×g離心10 min，收集菌體，用1/10體積菌體裂解液或PBS重懸，然后用JNBIO高壓細(xì)胞破碎儀破碎3次（1300 pa），4℃、12 000 ×g離心10 min，收集上清。加入終濃度為0.5%聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）混勻，4℃、14 000 ×g離心10 min，離心收集上清用于重組蛋白純化。

1.4 重組蛋白純化ELP融合蛋白的相變循環(huán)按文獻(xiàn)[8] 進(jìn)行，純化ELP-VP2融合蛋白的相變溫度為26℃，氯化鈉濃度為1.5 mol/L；純化ELP-PR1融合蛋白的相變溫度為26℃，用0.4 mol/L硫酸銨和1 mol/L尿素進(jìn)行。孵育10 min后，室溫、12 000 ×g離心5 min，沉淀用預(yù)冷PBS重懸，冰浴30 min，4℃、12 000 ×g離心10 min去除不溶性雜蛋白，必要時(shí)重復(fù)1次相變循環(huán)。ELK-PR1融合蛋白純化按文獻(xiàn)[10-11] 進(jìn)行，將高壓破碎菌液在4℃、12 000 ×g離心10 min，沉淀蛋白先用洗滌液1（50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/LNaCl、2 mol/L尿素、1% Triton X-100、1 mmol/LEDTA、3 mmol/LDTT, pH 8.0）離心洗滌2次（4℃、1000 ×g離心10 min），再用洗滌液2（50 mmol/LTris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.5% Triton X-100, pH 7.2）離心洗滌3次，最后用1%Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素，PBS離心洗滌2次后備用。His-PR1融合蛋白的純化按照康為世紀(jì)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 ELP標(biāo)簽切除ELP-VP2融合蛋白標(biāo)簽切除按文獻(xiàn)[11] 進(jìn)行，沉淀的融合蛋白先用預(yù)冷TEV蛋白酶反應(yīng)液4℃復(fù)溶，按1∶30 μg比例與TEV蛋白酶活性包涵體混合，30℃孵育6 h；4℃、12 000 ×g離心10 min，去除蛋白酶活性包涵體，上清液加入2 mol/L氯化鈉在26℃條件下再次相變循環(huán)，離心去除ELP蛋白沉淀，上清液用PBS透析1次。

1.6 小鼠免疫將20只6周齡Balb/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組4只，分別為VP2、VP2+IFA（不完全弗氏佐劑）、VP2+ ELP-PR1、VP2+ELK-PR1和VP2+His-PR1免疫組，免疫途徑為腿部肌肉注射，抗原用量為20μg/只，所用3種PR-1融合蛋白摩爾濃度相同，His-PR1用量為10μg/只，ELP-PR1用量為26.6 μg/只，ELK-PR1用量為12.4μg/只，首免后2周加強(qiáng)免疫1次。首免后每周眶下靜脈叢采血分離血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 免疫小鼠抗體檢測(cè)免疫小鼠血清的VP2特異IgG、IgG1和IgG2c用間接ELISA檢測(cè)，包被抗原為純化VP2重組蛋白（5 μg/mL），4℃包被過夜，PBST（含0.1%Tween-20的PBS，pH7.4）洗板3次；封閉液為含5%脫脂乳粉的PBST，37℃封閉1 h；PBST洗板3次，各孔依次加入連續(xù)倍比稀釋（從1∶100開始）的免疫小鼠血清，37℃作用1 h；PBST洗板3次，加入酶標(biāo)羊抗鼠IgG、IgG1或IgG2c，37℃作用1 h；PBST洗板3次，每孔加入100 μL顯色液，室溫避光顯色20 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD450值，將P/N ≥ 2.1判為陽(yáng)性，P/N ＜ 1.5判為陰性。

1.8 免疫小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)初免后28 d采血分離血清，按照細(xì)胞因子檢測(cè)ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10濃度，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算平均值（x）及標(biāo)準(zhǔn)誤（s）。

2 結(jié)果

2.1 重組VP2蛋白表達(dá)與純化將ELP-VP2重組載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用0.2 mmol/L IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)6 h。SDS-PAGE分析顯示表達(dá)的ELP-VP2融合蛋白為66.6 kDa，與預(yù)期相符，經(jīng)過2次相變循環(huán)純化的融合蛋白純度為95%；用TEV蛋白酶活性包涵體切除ELP標(biāo)簽，再次相變循環(huán)回收的重組VP2蛋白為預(yù)期的13 kDa，純度為95%（圖1）。

2.2 PR-1融合蛋白的表達(dá)與純化分別將His-PR1、ELK-PR1和ELP-PR1融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用0.2 mmol/L IPTG在37℃誘導(dǎo)6 h，SDS-PAGE分析顯示表達(dá)的His-PR1、ELK-PR1、ELP-PR1融合蛋白分別為預(yù)期的23、28、60 kDa（圖2）。其中，His-PR1融合蛋白為不溶性包涵體表達(dá)，在變性條件下用鎳親和柱純化；ELK-PR1融合蛋白為活性包涵體表達(dá)，用離心洗滌法純化；ELP-PR1融合蛋白為可溶性表達(dá)，用相變循環(huán)純化（表1）。

圖1 ELP-VP2融合蛋白表達(dá)、純化與標(biāo)簽切除Fig.1 Expression, purification and tag cleavage of ELPVP2 fusion protein

表1 三種PR-1融合蛋白的純化指標(biāo)Table 1 Purification performance of three PR-1 fusion proteins

2.3 免疫小鼠抗體水平檢測(cè)在初次免疫后第1周和第4周，對(duì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠采血分離血清，以重組VP2蛋白為檢測(cè)抗原，用間接ELISA檢測(cè)抗原特異性IgG、IgG1和IgG2c。在初免后d7，His-PR1佐劑組總IgG水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IFA、ELK-PR1和ELP+PR1佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中ELP+PR1佐劑組總IgG水平最高；His-PR1和IFA佐劑組的IgG1水平與VP2免疫對(duì)照組差異不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ELP-PR1佐劑組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ELK-PR1佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4個(gè)佐劑組的IgG2c水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中ELP-PR1佐劑組的IgG2c水平最高（圖3）。在初免后28 d，4個(gè)佐劑組的總IgG水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中ELP-PR1佐劑組總IgG水平最高；His-PR1佐劑組的IgG1水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他3個(gè)佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4個(gè)佐劑組的IgG2c水平與VP2免疫對(duì)照組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中ELP-PR1佐劑組IgG2c水平最高（圖4）。

圖2 三個(gè)PR-1融合蛋白的表達(dá)及純化Fig.2 Expression and purification of thee PR-1 fusion proteins

2.4 小鼠血清細(xì)胞因子檢測(cè)在初免后28 d采血分離血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子濃度。與VP2免疫組對(duì)照相比，ELP-PR1佐劑組的IFN-γ水平差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他3個(gè)佐劑組差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5A）；與VP2免疫對(duì)照組相比，ELK-PR1佐劑組的IL-6水平差異具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ELP-PR1佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ELK-PR1和His-PR1佐劑組差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5B）；與VP2免疫對(duì)照組相比，ELP-PR1免疫組的IL-10水平差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他3個(gè)佐劑組差異具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5C）；與VP2免疫對(duì)照組相比，IFA佐劑組的TNF-α水平差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他3個(gè)佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5D）。

圖3 免疫小鼠的VP2特異抗體檢測(cè)（初免后d7）Fig. 3 Detection of VP2-specific antibody response in mice on day 7 after immunization

圖4 免疫小鼠的VP2特異抗體檢測(cè)（初免后d28）Fig. 4 Detection of VP2-specific antibody response in mice on day 28 after immunization

3 討論

重組蛋白和合成肽等亞單位疫苗安全性較好，但免疫原性較差，需與適當(dāng)佐劑配合使用。鋁鹽和油乳劑等傳統(tǒng)免疫佐劑可以加強(qiáng)疫苗抗原的體液免疫應(yīng)答，但不能形成有效的細(xì)胞免疫。Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）等模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）可以激活抗原提呈細(xì)胞和促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，在先天性和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，因此TLR是一種具有很大應(yīng)用前景的新型免疫佐劑[13]。Ov-ASP-1是TLR2和TLR4的配體，具有很強(qiáng)的免疫佐劑活性，活性區(qū)位于核心致病性相關(guān)-1（PR-1）結(jié)構(gòu)域[6]。重組大腸桿菌表達(dá)的PR-1不僅對(duì)卵清蛋白和乙肝表面抗原等具有體液免疫增強(qiáng)作用，還能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答[6]，但其表達(dá)產(chǎn)物需用鎳親和柱純化，成本較高，難以規(guī)模化制備，在獸醫(yī)臨床使用中受到限制。ELP是根據(jù)體內(nèi)彈性蛋白重復(fù)序列合成的多聚體，具有免疫原低、體內(nèi)相容性好等優(yōu)點(diǎn)，已作為藥物傳送載體和組織工程材料被研究人員進(jìn)行開發(fā)。更為重要的是，ELP具有溫度敏感的可逆相變特性，其融合蛋白可用簡(jiǎn)單的相變循環(huán)純化，是近年來(lái)快速發(fā)展的重組蛋白純化標(biāo)簽[8]。本研究中，ELP-PR1融合蛋白純化可以在2.5 h內(nèi)完成，純化蛋白的純度高達(dá)93%，與鎳親和層析純化His-PR1融合蛋白的效率（95%）接近。親和層析純化His-PR1融合蛋白的回收率和產(chǎn)量高于ELP-PR1融合蛋白，但需用價(jià)格較貴的鎳親和層析柱，而且純化過程需時(shí)長(zhǎng)達(dá)21 h，而ELP-PR1融合蛋白的純化僅需氯化鈉等常規(guī)化學(xué)試劑和離心機(jī)等簡(jiǎn)單設(shè)備。ELK16等自聚肽能自動(dòng)聚集成活性包涵體，因此其融合蛋白也可用簡(jiǎn)單的離心洗滌法純化[10-11]，這在本研究中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖5 免疫小鼠血清細(xì)胞因子檢測(cè)Fig.5 Detection of cytokines in immunized mouse serum

自然環(huán)境中IBDV廣泛存在，疫苗使用非常普遍，所以難以找到適合免疫應(yīng)答研究的非免疫雛雞或雞胚，即使是非免疫雛雞或雞胚也不能保證無(wú)IBDV母源抗體存在。SPF雛雞不僅來(lái)源受限、價(jià)格較貴，試驗(yàn)過程中也容易受到IBDV污染而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。小鼠為IBDV非易感動(dòng)物，SPF小鼠不僅來(lái)源方便，試驗(yàn)過程中也不會(huì)受到IBDV污染。因此，本研究分別將3種PR-1融合蛋白與IBDV重組VP2抗原進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn)，以便對(duì)重組VP2抗原的免疫原性及其所需免疫佐劑進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

初免后7 d，3個(gè)PR-1佐劑組VP2特異IgG滴度較VP2免疫對(duì)照組均有顯著提高，其中ELP-PR1佐劑組升高最顯著，ELK-PR1佐劑組與IFA佐劑組相當(dāng)，His-PR1佐劑組較差。在初免后28 d，3個(gè)PR-1佐劑組VP2特異IgG滴度均進(jìn)一步升高，但抗體水平變化相似。除抗原特異性IgG1滴度不同程度升高外，3個(gè)PR-1佐劑組的IgG2c水平也有顯著升高，進(jìn)一步證明Ov-ASP-1的PR-1結(jié)構(gòu)域不僅能誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2應(yīng)答，還能將免疫應(yīng)答向Th1偏移。在3個(gè)融合標(biāo)簽中，ELP不僅分子量最大（55 kDa），還能在體內(nèi)形成顆粒樣結(jié)構(gòu)，可能是ELP-PR1佐劑活性較強(qiáng)的原因所在。His標(biāo)簽分子量最小（0.5 kDa），加之PR-1分子量也較?。?6 kDa），His-PR1免疫佐劑活性較低可能與其降解速度較快有關(guān)。

細(xì)胞因子包括Th1和Th2類細(xì)胞因子，前者代表性細(xì)胞因子主要包括IL-6、IFN-γ和TNF-α，主要參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)；后者代表性細(xì)胞因子主要有IL-4和IL-10，主要參與體液免疫調(diào)節(jié)[14]。在3個(gè)PR-1佐劑組中，ELP-PR1對(duì)IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α四種細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激作用均較強(qiáng)，可能與其自身免疫佐劑活性有關(guān)。ELK-PR1 對(duì)IL-6、IL-10和TNF-α產(chǎn)生的刺激作用較強(qiáng)，而His-PR1對(duì)IL-10和TNF-α產(chǎn)生的刺激作用較強(qiáng)。研究結(jié)果不僅證明PR-1能刺激Th1和Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生，而且提示不同融合標(biāo)簽對(duì)PR-1刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類可以產(chǎn)生影響。