醫(yī)院制劑補(bǔ)血通絡(luò)丸的HPLC 指紋圖譜研究

陳瑩 梁棟 王小川 李國宏 梁穎 何捷

補(bǔ)血通絡(luò)丸是由本院醫(yī)生協(xié)定處方研制而成, 由黃芪、三七、當(dāng)歸、地龍、甘草配伍組成, 具有補(bǔ)益氣血、活血通絡(luò)的功效, 主要用于股骨頭壞死及各類骨傷疼痛?，F(xiàn)執(zhí)行的制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對黃芪進(jìn)行薄層鑒別, 處方其他藥物無控制手段, 不能全面反映該制劑質(zhì)量狀況。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段, 其是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上, 可用于評價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性［1］。因此, 本文在參考文獻(xiàn)［2-7］的基礎(chǔ)上, 以補(bǔ)血通絡(luò)丸為研究對象, 利用指紋圖譜的研究思路, 考察多種成分的變化情況, 對該制劑進(jìn)行指紋圖譜研究, 用于產(chǎn)品批次間質(zhì)量穩(wěn)定性評價(jià), 同時(shí)為后續(xù)全面提高該制劑質(zhì)量水平提供依據(jù)和參考, 報(bào)告如下。

1 材料來源

1.1 藥品與試劑 甘草苷(批號：111610-201005, 中國藥品生物制品檢定所)；10 批次補(bǔ)血通絡(luò)丸均由內(nèi)江市中醫(yī)醫(yī)院提供。見表1。乙腈(Flesher)色譜純；甲醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司)分析純、磷酸(西隴化工股份有限公司)分析純；水為超純水。

表1 補(bǔ)血通絡(luò)丸樣品批號表

1.2 儀器 高效液相色譜儀(Agilent1260)；電子分析天平(梅特勒-托力多AG285)；超純水機(jī)(上海摩勒科Molelement-1890V)；超聲波清洗機(jī)(天津市瑞普電子儀器公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent ZorbaxSB-C18色譜柱(4.6 mm× 250.0 mm, 5 μm), 以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相, 即以乙腈為流動(dòng)相A、以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B, 按流動(dòng)相梯度洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫。流動(dòng)相梯度洗脫程序見表2。檢測波長為220 nm, 柱溫 25℃, 流速為1.0 ml/min, 進(jìn)樣量為10 μl,檢測時(shí)間為65 min。理論板數(shù)按甘草苷計(jì)算應(yīng)≥5000。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 制備對照品溶液 取甘草苷對照品適量, 精密稱定, 加入甲醇, 制成每1 ml 中含甘草苷50 μg 的溶液, 作為對照品溶液。

2.2.2 制備供試品溶液 取補(bǔ)血通絡(luò)丸適量, 研細(xì), 混勻, 取約1 g, 精密稱定, 置具塞錐形瓶中, 加甲醇50 ml, 密塞, 超聲處理(功率250 W, 頻率40 kHz)30 min, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液, 即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)的考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批補(bǔ)血通絡(luò)丸制成的供試品溶液(批號：170911), 連續(xù)進(jìn)樣6 次, 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定, 結(jié)果各共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD 值均＜2.0%。該方法和儀器的精密度均良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批補(bǔ)血通絡(luò)丸制成的供試品 溶液(批號：170911), 分別在0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、24.0 h 進(jìn)樣分析, 記錄HPLC 圖譜, 采用2012 年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》進(jìn)行評價(jià), 各色譜圖的相似度＞0.95, 相對峰面積的RSD 值＜1.5%, 供試品溶液在放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批補(bǔ)血通絡(luò)丸(批號：170911), 按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行操作, 制備6 份供試品溶液, 分別進(jìn)樣分析, 記錄HPLC 圖譜, 采用2012 年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》進(jìn)行評價(jià), 相似度均＞0.95, 且RSD 值為0.38%, 該方法重復(fù)性好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

2.4.1 指紋圖譜的建立 分別取10 批次補(bǔ)血通絡(luò)丸, 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定并記錄65 min 色譜圖, 結(jié)果所有色譜峰均集中在60 min內(nèi)。選擇5～65 min 中色譜峰, 時(shí)間窗寬度為0.2 min, 進(jìn)行全峰匹配。10 批次樣品色譜圖中, 有19 個(gè)共有峰, 且共有峰總面積占總峰面積＞85%, 由此建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜。見圖1。經(jīng)與對照品色譜圖相比對, 可確認(rèn)圖中5 號峰為甘草苷、6 號峰為阿魏酸。由于5 號峰峰面積相對較大且保留時(shí)間適中, 且為補(bǔ)血通絡(luò)丸中的主要活性成分, 因此選該峰為內(nèi)參比峰。計(jì)算共有峰峰面積和保留時(shí)間相當(dāng)于內(nèi)參比峰峰面積和保留時(shí)間的比值。各樣品共有峰的相對保留時(shí)間(平均值)依次為：0.406、0.539、0.913、0.963、1.000(S)、1.060、1.455、1.656、1.735、1.875、1.945、2.370、2.449、2.480、2.547、2.574、2.768、3.059、3.487；各樣品共有峰的峰面積全部標(biāo)定并計(jì)算(取平均值)依次為：0.373、0.497、0.407、1.353、1.000(S)、0.232、0.272、0.292、0.271、0.753、0.588、0.249、0.152、0.264、0.135、0.137、0.197、0.606、0.641。

圖1 補(bǔ)血通絡(luò)丸標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

2.4.2 相似度計(jì)算 將10 批次補(bǔ)血通絡(luò)丸色譜圖導(dǎo)入 2012 年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》, 與建立的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較, 并對10 批次樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析, 指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果分別為：0.979、0.980、0.973、0.981、0.961、0.962、0.974、0.973、0.979、0.954, 相似度均＞0.95。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對供試品提取溶劑、流動(dòng)相系統(tǒng)及檢測波長進(jìn)行了篩選研究。一般實(shí)驗(yàn)多用甲醇及50%甲醇提取, 甲醇及50%甲醇都能提取制劑中有效成分, 峰高也基本一致, 但甲醇提取的成分更多, 主要特征峰強(qiáng), 分離度最佳［8-10］, 故本研究選用甲醇作為樣品提取溶劑。選用乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相用于梯度洗脫, 所得19 個(gè)共有峰分離良好。用二極管陣列檢測器(DAD), 在203、220、240、250、270、290、300 nm 同時(shí)對一針樣品檢測, 檢測器在220 nm 處, 峰信號強(qiáng)且出峰多, 特征峰干擾少, 分離度好, 故本研究選用220nm作為指紋圖譜的檢測波長。

本研究建立的補(bǔ)血通絡(luò)丸指紋圖譜經(jīng)過方法學(xué)考察, 19 個(gè)共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性均好, 10 批次指紋圖譜的相似度均＞0.9, 能滿足中藥指紋圖譜測定要求, 且說明補(bǔ)血通絡(luò)丸的制備工藝穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)建立的補(bǔ)血通絡(luò)丸的指紋圖譜可用于該制劑的質(zhì)量控制, 評價(jià)批次間制劑的穩(wěn)定性, 同時(shí), 該方法比常用的薄層色譜法先進(jìn)、科學(xué), 更能全面反映產(chǎn)品質(zhì)量。