氮、磷、鉀脅迫對甘蔗生長及固氮酶活性的影響

黃曉財(cái)，胡浩南，李欣欣，敖俊華1,*，廖 紅

(1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州510642；3福建農(nóng)林大學(xué)根系生物學(xué)研究中心，福建福州350002)

0 引言

甘蔗是我國重要的糖料和能源作物，在人們?nèi)粘Ｉ詈蛧医?jīng)濟(jì)發(fā)展中起著舉足輕重的作用。氮(N)、磷(P)和鉀(K)是農(nóng)業(yè)肥料三要素，是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素。每生產(chǎn)1 t甘蔗需要獲取1.5～2 kg的N、1～1.5 kg的P以及2～2.5 kg的K[1]。N、P、K 的缺乏會(huì)嚴(yán)重抑制甘蔗生長、降低其生產(chǎn)力[2-3]。例如，缺氮能使甘蔗葉片黃化，植株矮小[3]；缺磷使甘蔗葉片花青素積累，抑制蔗莖及根系生長，影響光合導(dǎo)致糖分含量下降[4]；缺鉀使甘蔗中脈變紅，阻礙光合作用，降低轉(zhuǎn)化酶活性，降低分蘗數(shù)，植株瘦弱[5]。為提高或維持甘蔗產(chǎn)量，毋庸置疑，施肥是最直接、最快速的手段。然而，近年來由于不合理或過度施肥，不僅增加了農(nóng)業(yè)成本而且對人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞[6-7]。因此，研究不同施肥條件對甘蔗生長的影響，挖掘植物自身潛力結(jié)合合理的施肥措施，是提高甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)的有效途徑。

甘蔗是重要的聯(lián)合固氮作物[8]。研究表明，某些甘蔗品種可從生物固氮系統(tǒng)中獲取所需氮量的60%～70%[9]；同時(shí)，接種固氮菌，能顯著提高甘蔗根及地上部的氮含量和生物量[10-11]，這暗示了聯(lián)合固氮作用在甘蔗生產(chǎn)及可持續(xù)生態(tài)農(nóng)業(yè)中的重要性。內(nèi)生固氮菌種類較多，且能夠定殖于甘蔗不同組織部位，包括根、莖和葉[12-14]。不同組織部位中固氮菌的固氮酶活性存在明顯差異，固氮酶活性亦是衡量生物固氮效率較為重要的指標(biāo)之一。然而，關(guān)于不同施肥處理對甘蔗固氮酶活性的影響的報(bào)道比較少見。本研究利用土培法，比較分析了粵糖93-159和 ROC22在不同施肥條件下的營養(yǎng)生長及固氮酶活性的變化，以期為甘蔗營養(yǎng)研究、養(yǎng)分管理及聯(lián)合固氮系統(tǒng)與養(yǎng)分相關(guān)聯(lián)的基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植株材料

供試甘蔗品種：ROC22、粵糖93-159。ROC22是臺(tái)灣糖業(yè)研究所利用母本ROC5和父本69-463培育而成，于1998年引入大陸并大面積種植，該品種中熟、高糖，現(xiàn)為我國種植面積最大的甘蔗品種；粵糖 93-159由廣州甘蔗糖業(yè)研究所利用母本粵農(nóng)73-204和父本CP72-1210育成，該品種特早熟高糖，在我國蔗區(qū)廣泛種植。

挑選長勢一致的甘蔗種莖，斬成長短一致的單芽苗，經(jīng)300倍多菌靈稀釋液浸泡5 min后，擺放于裝有河沙的育苗盤內(nèi)，待第4片真葉完全展開時(shí)，作為供試種苗。

1.1.2 供試土壤

試驗(yàn)土壤取自粵西蔗區(qū)，土壤類型為磚紅壤，土壤pH 4.9，有機(jī)質(zhì)20.11 g/kg，全氮0.62 g/kg，全磷0.50 g/kg，全鉀2.67 g/kg，堿解氮33.30 mg/kg，速效磷≤5.00 mg/kg，速效鉀35.22 mg/kg。

1.1.3 試驗(yàn)種植槽

試驗(yàn)種植槽為1 m×1 m×1.2 m (長×寬×深)的水泥槽，每槽裝供試土壤1 m3，移栽甘蔗種苗12株。肥料施用采用面積換算，施用量為農(nóng)民田間常規(guī)施用量的 2.5倍，農(nóng)民田間常規(guī)施用量為 N 498 kg/hm2、P2O5324 kg/hm2、K2O 540 kg/hm2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同甘蔗品種的施肥處理

試驗(yàn)設(shè) 4個(gè)施肥處理，3次重復(fù)。施肥處理包括：不施氮肥處理(-N)，即磷肥(P2O5)81.00 g/槽和鉀肥(K2O)135.00 g/槽；不施磷肥處理(-P)，即氮肥(N)124.20 g/槽和鉀肥(K2O)135.00 g/槽；不施鉀肥處理(-K)，即氮肥(N)124.20 g/槽和磷肥(P2O5)81.00 g/槽；氮磷鉀處理(NPK)，即氮肥(N)124.20 g/槽、磷肥(P2O5)81.00 g/槽、鉀肥(K2O)135.00 g/槽。磷肥為過磷酸鈣(P2O512%)，在基肥時(shí)一次性施入；氮肥為尿素(N 46%)，鉀肥為氯化鉀((K2O 60%)，分基肥和分蘗期追肥2次施用，2個(gè)時(shí)期施用比例分別為30%和70%。

供試甘蔗于2016年1月份移植，9月中旬測試甘蔗株高、莖徑并取樣，每株甘蔗從肥厚帶處剪取+4葉(甘蔗最高可見肥厚帶往下數(shù)的第4片葉，依此類推)和植株新鮮根系測定其固氮酶活性。

1.2.2 固氮酶活性測定

參考Kirchhof等[15]培養(yǎng)基方法，利用LGI培養(yǎng)基測定甘蔗固氮酶活性。其成分主要包括：K2HPO40.20 g/L、KH2PO40.60 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、CaCl2·2H2O 0.02 g/L、NaMoO4·2H2O 0.002 g/L、FeCl3·6H2O 0.01 g/L、蔗糖 100.00 g/L。

參照 Roesch等[16]及桂意云等[12]方法，分別將不同品種甘蔗的根，+4葉用自來水及無菌水沖洗后，再用剪刀切碎混均勻，并稱取1 g左右樣品，轉(zhuǎn)入60 mL培養(yǎng)瓶中，分別加入10 mL上述LGI培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)48 h后，用針筒抽出1 mL氣體并同時(shí)注入等體積的乙炔繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，隨后加入50%三氯乙酸1 mL終止反應(yīng)，并使用氣相色譜儀測定形成乙烯的量。每個(gè)部位3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以nmol(C2H4)·g-1(Fw)·h-1表示固氮酶活性大小，計(jì)算公式如下：

其中，C：標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的乙烯濃度(g/L)；V1：瓶子的體積(L)；V2：裝樣品所占用的體積(L)；M：乙烯分子量；FW：樣品鮮重(g)；H：加入乙炔后培養(yǎng)的時(shí)間(h)。

1.2.3 N、P、K濃度測定

將不同處理的甘蔗+2葉105℃殺青30 min后，75℃恒溫烘干粉碎。氮、磷使用連續(xù)流動(dòng)分析儀(型號(hào)為SAN++，產(chǎn)自荷蘭)測定；K使用火焰分光光度計(jì)測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，采用SigmaPlot進(jìn)行作圖，SPSS 16.0用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 不同施肥處理對不同甘蔗品種生長的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對甘蔗生長的影響

2.1.1 不同施肥處理對甘蔗株高和分蘗直徑的影響

分析粵糖93-159和ROC22在不同施肥條件下的株高及莖徑的變化，結(jié)果如圖1所示，不施氮肥(-N)顯著抑制了甘蔗生長，粵糖 93-159和 ROC22的株高(圖1A)和莖徑(圖1B)均明顯低于氮磷鉀處理(NPK)，粵糖 93-159的株高和莖徑分別降低了74.49%、17.48%，ROC22降低了78.28%、68.75%；在不施磷肥(-P)處理下，粵糖 93-159的株高顯著低于NPK，而-P并未影響ROC22的株高以及2個(gè)甘蔗品種的莖徑；不施鉀肥(-K)處理的 2個(gè)甘蔗品種株高和莖徑與NPK處理具有相似的趨勢，品種內(nèi)無顯著差異。另外，無論哪種施肥條件，ROC22的株高要顯著高于粵糖93-159(圖1A)，而-N處理下，粵糖93-159的莖徑要明顯高于ROC22。通過不同施肥條件的比較分析，說明缺氮會(huì)嚴(yán)重抑制甘蔗生長發(fā)育。

2.1.2 不同施肥處理對不同甘蔗有效莖數(shù)的影響

不同施肥處理對甘蔗有效莖數(shù)的影響結(jié)果分析表明(表 1)：-N和-P顯著減少了不同甘蔗品種的有效莖數(shù)。在-N條件下，粵糖93-159和ROC22的有效莖數(shù)分別降低了 78.0%和 64.7%；在-P條件下，分別降低了 68.3%和 58.8%。在-K條件下，粵糖93-159的有效莖數(shù)降低了41.5%，而對ROC22無顯著影響。此外，在同一施肥水平下，粵糖93-159的有效莖數(shù)均要多于ROC22，暗示了粵糖93-159可能具有較高的氮磷鉀養(yǎng)分效率。

表1 不同甘蔗品種在不同施肥條件下的有效莖數(shù)

2.2 不同施肥處理下甘蔗葉片N、P、K濃度的變化

甘蔗+2葉為甘蔗最高可見肥厚帶往下數(shù)的第2片葉，其為甘蔗的重要功能葉片。通過分析不同施肥條件下甘蔗+2葉片的 N、P、K濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同施肥處理對不同甘蔗品種的養(yǎng)分濃度影響不同。-N處理提高了粵糖93-159和ROC22的+2葉N濃度(圖 2A)，與對照相比，分別增加了 45.4%和15.3%。粵糖93-159在-P和-K條件下，甘蔗+2葉N濃度與對照相比，表現(xiàn)相反的差異：-P處理下，其+2葉N濃度降低了21.2%，-K條件下的N濃度提高了28.8%；然而，ROC22在-P和-K處理下+2葉的N濃度與NPK相比無顯著差異。

不施磷肥顯著降低了甘蔗+2葉的 P濃度(圖2B)。與對照相比，粵糖93-159和ROC22的+2葉P濃度分別降低了58.7%和28.0%。而不施氮肥時(shí)，顯著增加了2種甘蔗品種+2葉的P濃度，粵糖93-159的P濃度較對照增加了211.1%，ROC22的P濃度較對照增加了 30.3%。然而，不施鉀肥處理下，粵糖93-159和ROC22的+2葉P濃度與對照相比，無明顯差異。

由圖2C可知，不施鉀肥條件下，ROC22+2葉的K濃度較對照降低了50.2%；而粵糖93-159的+2葉K濃度雖然存在下降趨勢，但與 NPK相比無顯著差異。然而，在-N條件下，粵糖93-159和ROC22的+2葉 K濃度均顯著增加，分別提高了 46.3%和32.8%。在不施磷肥條件下，2種甘蔗品種+2葉的K濃度與對照相比，無顯著差異。

2.3 不同施肥處理對甘蔗根和葉固氮酶活性的影響

利用 LGI培養(yǎng)基培養(yǎng)不同品種甘蔗根系及+4葉，并測定其固氮酶活性。結(jié)果如圖 3A所示，不施氮肥時(shí)，顯著提高ROC22根系的固氮酶活性，而粵糖93-159根系的固氮酶活性提高不明顯。在不施磷、鉀肥及對照條件下，ROC22的固氮酶活性均較低；粵糖93-159在不同施肥條件下根系的固氮酶活性相對較高，總體變化趨勢是-N＞NPK＞-K＞-P。

在+4葉中，粵糖 93-159的固氮酶活性在不施氮肥條件下最高，為 302.27 nmol (C2H4)·g-1(Fw)·h-1；其次是不施磷和鉀肥處理，而對照條件下的固氮酶活性最低。然而，ROC22的+4葉固氮酶活性在不施磷肥條件下最高；不施氮肥亦能提高其固氮酶活性，比NPK提高了144.0%；不施鉀肥處理抑制了ROC22的固氮酶活性，NP較NPK降低了76.3%。說明，不同施肥條件對不同甘蔗品種的內(nèi)生固氮菌菌落存在不同程度的調(diào)控，進(jìn)而不同程度地影響了固氮酶活性。

3 討論與結(jié)論

甘蔗是高光效的 C4作物，生長周期長，生物量高，對養(yǎng)分需求大。眾所周知，氮、磷和鉀是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素。其中，氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要成分，是植物需求量最大的礦質(zhì)養(yǎng)分；磷是細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是磷脂、核酸和核蛋白等的重要組分；鉀參與植物生理生化代謝過程，維持某些代謝酶的活性。然而，土壤養(yǎng)分有效性低往往是限制甘蔗產(chǎn)量的主要因素之一。挖掘作物自身潛力，結(jié)合合理施肥措施是提高產(chǎn)量經(jīng)濟(jì)有效的策略。本研究設(shè)置了不施氮肥、不施磷肥、不施鉀肥和對照4個(gè)處理，分析了在不同處理下，不同甘蔗品種的生長及固氮酶活性變化。我們的結(jié)果顯示，在不施氮肥條件下，顯著抑制了粵糖 93-159和 ROC22的株高(圖 1A)、莖徑(圖 1B)及有效莖數(shù)(表 1)；不施磷肥處理，顯著抑制了不同甘蔗品種的株高(圖1A)和有效莖數(shù)(表1)，對甘蔗莖徑(圖1B)影響不大；不施鉀肥處理，除影響粵糖 93-159的有效莖數(shù)外，2種甘蔗的生長狀態(tài)與對照相比，無明顯差異。說明，甘蔗的生長依賴土壤氮、磷、鉀的供給；同時(shí)也暗示了，甘蔗本身可能對鉀具有一定的活化作用。

圖2 不同施肥處理對不同甘蔗品種+2葉中氮、磷及鉀濃度的影響

施肥不僅能影響植物本身生長發(fā)育過程，同時(shí)能改變土壤微生物群落[17]。甘蔗與固氮微生物形成的聯(lián)合固氮系統(tǒng)，受氮營養(yǎng)的調(diào)控作用，一般而言，低氮能促進(jìn)生物固氮的發(fā)生[18]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，田間氮肥用量的多少直接影響了內(nèi)生固氮菌在甘蔗體內(nèi)存在的數(shù)量，進(jìn)而影響了固氮作用[19]。此外，接種內(nèi)生固氮菌，能夠顯著提高植株根系和葉的氮含量，最終增加了甘蔗生物量[10-11]。我們的結(jié)果顯示，粵糖93-159和ROC22根系和+4葉中的固氮酶活性在不施氮肥條件下均較高(圖3)，說明缺氮促進(jìn)了甘蔗聯(lián)合固氮細(xì)菌的定殖，進(jìn)而使甘蔗葉片氮濃度在不施氮肥條件下最高(圖2A)。Panwar和Singh[20]發(fā)現(xiàn)，小麥接種固氮螺菌促進(jìn)了根系生長，進(jìn)而促進(jìn)了對其他土壤礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收；在甘蔗中分離的大部分內(nèi)生固氮菌，具有合成分泌 IAA、嗜鐵素和溶解無機(jī)磷等特性[21]。這暗示了，充分發(fā)揮聯(lián)合固氮作用對提高甘蔗營養(yǎng)高效的重要性。因此，本研究在不施氮肥條件下，甘蔗葉片的P和K濃度均比其他處理高。說明，充分發(fā)揮甘蔗聯(lián)合固氮作用不僅能增加植株對N的獲取，同時(shí)是提高甘蔗養(yǎng)分高效的重要策略，甘蔗的聯(lián)合固氮系統(tǒng)與土壤礦質(zhì)養(yǎng)分息息相關(guān)?；浱?3-159和ROC22在不同施肥條件下，各有優(yōu)勢。例如，ROC22的株高在本研究所設(shè)置的處理中均明顯高于粵糖93-159，而有效莖數(shù)表現(xiàn)出相反的結(jié)果；2個(gè)品種的固氮酶活性在不同施肥條件下也存在差異，研究結(jié)果可為甘蔗內(nèi)生固氮菌與礦質(zhì)養(yǎng)分的關(guān)系以及品種差異(選擇優(yōu)勢品種) 的研究提供一定理論依據(jù)。

因此，通過研究結(jié)果表明：氮、磷、鉀是甘蔗與固氮微生物聯(lián)合固氮系統(tǒng)形成的重要調(diào)控因素。不施氮肥顯著抑制了甘蔗的生長發(fā)育，甘蔗株高、莖徑和有效莖數(shù)，但促進(jìn)了甘蔗聯(lián)合固氮作用，顯著提高了根系和+4葉的固氮酶活性。不施磷肥顯著減少了甘蔗的有效莖數(shù)，并影響甘蔗的固氮酶活性和氮營養(yǎng)。

圖3 不同施肥處理對不同甘蔗品種根和葉固氮酶活性的影響