動(dòng)物的共生菌固氮

金明霞,王 怡,嵇保中,*,劉曙雯,徐立軍,張 磊,熊佳新,喻愛(ài)林,謝谷艾

1 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,南京 210037 2 江西省林業(yè)科學(xué)院,南昌 330013 3 南京中山陵園管理局,南京 210014

1888年,Beijerinck首次分離出具有固氮活性的微生物,1893年Glatz分離出厭氧型固氮梭菌,這些工作開(kāi)創(chuàng)了研究生物固氮和固氮微生物的科學(xué)領(lǐng)域[1]。1912年P(guān)eklo從蚜蟲(chóng)體內(nèi)分離獲得固氮菌[2],此后不同作者陸續(xù)開(kāi)展了白蟻[3- 5]、蚜蟲(chóng)[6]、小蠹蟲(chóng)[2]、藥材甲、谷盜、衣蛾、果蠅[7]等共生菌固氮能力的研究。由于缺乏高精度檢測(cè)儀器,這些早期研究并未提供動(dòng)物共生菌固氮的有力證據(jù)。這種局面直到乙炔還原法的出現(xiàn)才得以改變,乙炔還原法為生物固氮研究提供了簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,首先在白蟻共生菌固氮檢測(cè)中獲得成功[8- 9]。此后,針對(duì)不同昆蟲(chóng)的類(lèi)似工作陸續(xù)展開(kāi)[10- 11]。不僅測(cè)定固氮酶活性,還對(duì)消化道內(nèi)的共生固氮菌進(jìn)行分離鑒定[12- 13]。動(dòng)物共生固氮研究的另一重要進(jìn)展是分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,從而克服了許多固氮菌不能分離培養(yǎng)的局限。鉬鐵蛋白和鐵蛋白固氮酶系統(tǒng)中鐵蛋白由nifH基因編碼,nifH基因高度保守,對(duì)其檢測(cè)可用于固氮菌類(lèi)群鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[14]。雖然國(guó)外對(duì)動(dòng)物共生菌固氮的研究已逾百載,但國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究尚處于起步階段。黃小芳等[1]、王亞召等[14]曾分別撰文介紹海洋動(dòng)物和白蟻共生菌固氮的研究情況。本文從動(dòng)物共生菌固氮涉及的動(dòng)物和微生物類(lèi)群、動(dòng)物共生菌固氮的性質(zhì)和機(jī)理等角度,介紹動(dòng)物共生菌固氮的研究進(jìn)展。

1 共生菌固氮涉及的動(dòng)物類(lèi)群

一般認(rèn)為,動(dòng)物共生菌固氮現(xiàn)象主要存在于貧氮營(yíng)養(yǎng)型動(dòng)物,如珊瑚、白蟻、船蛆、食木鯰魚(yú)等。但已報(bào)道具有固氮酶活性或具有固氮酶基因的動(dòng)物已遠(yuǎn)超上述范疇,涉及的動(dòng)物包括海綿、珊瑚、蚯蚓、磷蝦、馬陸、昆蟲(chóng)、蝸牛、船蛆、松雞、奶牛、山羊、豬、河貍、沙鼠、豚鼠、人類(lèi)等。據(jù)本文統(tǒng)計(jì),已報(bào)道共生菌固氮?jiǎng)游镉?門(mén)13綱23目50科99屬174種(見(jiàn)表1) 。

表1 已報(bào)道的共生菌固氮?jiǎng)游?

▲：乙炔還原法；◆：固氮酶基因檢測(cè)；★：15N同位素檢測(cè)；●：固氮菌分離鑒定

從海綿到人類(lèi),涉及低等到高等多種動(dòng)物類(lèi)群。其中有貧氮營(yíng)養(yǎng)型動(dòng)物,也有雜食性動(dòng)物。表1所列174種動(dòng)物中,多孔動(dòng)物門(mén)2種(1.15%),刺胞動(dòng)物門(mén)17種(9.77%),線(xiàn)蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)1種(0.58%),環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)9種(5.17%),節(jié)肢動(dòng)物門(mén)113種(64.94%),軟體動(dòng)物門(mén)11種(6.32%),脊索動(dòng)物門(mén)21種(12.07%)。節(jié)肢動(dòng)物種類(lèi)最多,其次為脊索動(dòng)物、刺胞動(dòng)物、軟體動(dòng)物和環(huán)節(jié)動(dòng)物,多孔動(dòng)物和線(xiàn)蟲(chóng)動(dòng)物僅有少量研究。節(jié)肢動(dòng)物113種中昆蟲(chóng)綱109種,占96.5%。昆蟲(chóng)綱中等翅目75種,占昆蟲(chóng)綱種類(lèi)的68.8%；鞘翅目18種,占16.5%；膜翅目13種,占11.9%。脊索動(dòng)物21種中,輻鰭魚(yú)綱1種,鳥(niǎo)綱2種,哺乳綱18種。刺胞動(dòng)物17種全部為珊瑚綱種類(lèi),其中石珊瑚目16種,柳珊瑚目1種。

2 動(dòng)物共生固氮菌的類(lèi)群特點(diǎn)

2.1 常見(jiàn)種類(lèi)

表2所列52種動(dòng)物所涉及固氮菌87屬137種,大多數(shù)種類(lèi)屬于細(xì)菌,也有少數(shù)古菌,如Methanobacteriumivanovii[94]和魯米葉甲烷馬賽里球菌[93]。水生動(dòng)物中還發(fā)現(xiàn)有藻類(lèi)[24,49]。按出現(xiàn)頻次,表2所列固氮菌中常見(jiàn)種類(lèi)有慢生根瘤菌Bradyrhizobiumsp.(8次)、腸桿菌Enterobactersp.(7次)、肺炎克雷伯氏菌(6次)、葡萄球菌Staphylococcussp.(5次)、腸桿菌Enterobacteriaceaesp.(5次)、鏈球菌Streptococcussp.(4次)、法氏檸檬酸桿菌(4次)。出現(xiàn)3次的有11種,分別為圓褐固氮菌、擬桿菌Bacteroidessp.、芽孢桿菌Bacillussp.、巴氏固氮梭菌、催娩克雷白氏菌、Klebsiellasp.、甲基孢囊菌Methylocystissp.、根瘤菌Rhizobiumsp.、紅球菌Rhodococcussp.、中華根瘤菌Sinorhizobiumsp.、密螺旋體Treponemasp.。出現(xiàn)2次的有23種。出現(xiàn)1次的96種,約占全部種類(lèi)的70%。多數(shù)種類(lèi)僅出現(xiàn)1次,表明研究的動(dòng)物種類(lèi)仍然較少,發(fā)現(xiàn)的固氮菌種類(lèi)較為分散,實(shí)際蘊(yùn)含的種類(lèi)資源可能更為豐富(表2中固氮菌生態(tài)類(lèi)型劃分為：A：植物共生固氮菌；B：植物內(nèi)生固氮菌；C：植物根際固氮菌；D：自生固氮菌；AB：植物共生/植物內(nèi)生固氮菌；AD：植物共生/自生固氮菌；BC：植物內(nèi)生/植物根際固氮菌；BD：植物內(nèi)生/自生固氮菌)[102-116]。

表2 動(dòng)物共生固氮菌種類(lèi)與生態(tài)類(lèi)型

Table 2 The Species and ecological types of animal symbiotic nitrogen xation bacteria

表2 動(dòng)物共生固氮菌種類(lèi)與生態(tài)類(lèi)型

宿主/固氮菌種類(lèi)/文獻(xiàn)來(lái)源Host/Types of symbiotic nitrogen-fixing bacteria/Literature sources宿主/固氮菌種類(lèi)/文獻(xiàn)來(lái)源Host/Types of symbiotic nitrogen-fixing bacteria/Literature sources多孔動(dòng)物門(mén)Porifera、尋常海綿綱 DemospongiaeNasutitermes graveolus/Enterobacter sp., Staphylococcus sp.[13]Ircinia strobilina, Mycale laxissima/DAzotobacter chroococum, DDesulfovibrio salexigens, Leptolyngbya sp., Methylocystis sp., Myxosarcina sp., Tolypothrix sp., Trichodesmium thiebautii[18]Nasutitermes nigriceps/Ensifer sp.[70]刺胞動(dòng)物門(mén)Cnidaria、珊瑚綱AnthozoaNeotermes castaneus/Arthrobacter sp., Bacteroides. Enterobacteriaceae, Myxobacterales, CStaphylococcus sp.[90]Acropora millepora/Alphaproteobacteria sp., Bradyrhizobium sp.,Cyanobacteria sp., Deltaproteobacteria sp., Desulfuromonas sp.,Gammaproteobacteria sp., Myxosarcina sp., Sinorhizobium sp., Xenococcus sp.[23]Macrotermes sp./Azotobacter sp., Beijerinckia sp., DClostridium pasteur-ianumm, Klebsiella sp.[60]A. robusta/Bradyrhizobium sp., Paenibacillus durus, Rhizobium sp., Sinorhizobium sp.[27]Odontotermes formosanus/BDKlebsiella pneumoniae[95]; BKlebsiella variicola[80]Pocillopora damicornis, Acropora millepora, A. muricata/Bradyrhizobium sp., Cylindrospermopsisraciborskii, DDesulfovibrio salexigens, Dickeya dadantii, Methylobacter luteus, Methylocystis echinoides, Nodularia spumigena, Trichodesmium erythraeum, Wolinella succinogenes[25]Odontotaenius disjunctus/Paludibacter propionicigenes[88]Montipora capitata, M. flabellata/BAcetobacter diazotrophicus,DAzomonas agilis, BDA. macrocytogenes, BCAzospirillum lipoferum, DAzotobacter chroococcum, DA. vineladii, Bradyrhizobium sp.,Desulfobacter latus, Halorhodospira halophila, Marichromatium purpura-tum, AMesorhizobium loti[35]Conorhynchus pistor/BDKlebsiella pneumonia[17]Porites lutea/Acetobacterium woodii, ABradyrhizobium japonicum, ABBurkholderia cepacia, Chroococcidiopsis sp., CClostridium themocel-lum, Ideonella sp., Leptolyngbya minuta, L. nodulosa, Marichromatum purpuratum, CPseudomonas stutzeri[49]Dendroctonus frontalis, D. terebrans, Ips avulsus/Enterobacter aerogenes, BE. agglomerans, E. sp.[20]Pocillopora damicornis/BCAzospirillum brasilensis, ABradyrhizobium denitrificans, B. sp., Chlorobium limicola, C. phaeobacteroides,BKlebsiella pneumoniae, Klebsiella sp., ARhizobium rosettiformans, Sinorhizobium sp., Teredinibacter turnerae[49]; DAzotobacter chroococcum, BCAzospirillum halopraeferens, ABradyrhizobium denitrificans, Klebsiella sp., CPseudomonas stutzeri, Rhizobium sp.[96]Dendroctonus valens, D. rhizophagus /DRaoultella terrigena[21]環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)Annelida、寡毛綱 ClitellataBactrocera tryoni/BCKlebsiella oxytoca[31]Pheretima vittata/BCKlebsiella oxytoca[63]Ceratitis capitata/DCitrobacter freundii, Enterobacter sp., Erwinia amylo-vara, BCKlebsiella planticola, BDK. pneumoniae, BCK. oxytoca, Pectobacte-rium carotovora, P. cypripedii, BPantoea agglomerans[34]節(jié)肢動(dòng)物門(mén)Arthropoda軟甲綱Malacostraca、磷蝦目Euphausiacea;甲殼綱Crustacea、橈足亞綱 CopepodaAcromyrmex octospinosus/Rhizobiales[39]Euphausia sp., Copepods/Chlorobium tepidum, DChromatium purpuratum, Desulfobacter curvatus, Desulfonema limicola[66]Tetraponera binghami/Burkholderia sp., Flavobacterium sp., Rhizobium sp., Methylobacterium sp., Pseudomonas sp.[51]昆蟲(chóng)綱Insecta軟體動(dòng)物門(mén)Mollusca、雙殼綱BivalviaCryptocercus punctulatus/Desulfovibrio sp.[75]Lyrodus pedicellatus/Teredinibacter turnerae[97]Mastotermes darwiniensis/DCitrobacter freundii[12]; Enterobacter sp., Flavobacterium sp., Streptococcus sp.[13]; Desulfovibrio sp.[22]脊索動(dòng)物門(mén)Chordata、輻鰭魚(yú)綱ActinopterygiiZootermopsis angusticollis/Treponema sp.[98]Panaque nigrolineatus/BDAzomonas macrocytogenes, AAzorhizobium doebere-inerae, ABradyrhizobium japonicum, B. sp., Cellulosilyticum lentocellum, CClostridium arbusti, C. beijerinckii, CC. papyrosolvens, CC. tyrobutyricum, Desulfomonile tiedjei,Methylocystis parvus, M. sp., Opitutaceae, ASinorhizobium meliloti, CSphingomonas azotifigens[67]Cryptotermes primus/Enterobacter sp., Streptococcus sp.[13]脊索動(dòng)物門(mén)Chordata、哺乳綱MammaliaCoptotermes formosanus/BEnterobacter agglomerans[99]; Acinetobacter sp., BDKlebsiella pneumonia[100]Bos tauru/Acinetobacter baumannii, BCBacillus methylotrophicus, BB. sonorensis, CStaphylococcus caprae[72]Coptotermes lacteus/DCitrobacter freundii[12];Enterobacter sp., Strepto-coccus sp.[13]Susscrofa domestica, Cavia porcellus/BCEnterobacter cloacae, Klebsiella aero-genes[79]

表2 動(dòng)物共生固氮菌種類(lèi)與生態(tài)類(lèi)型

續(xù)表宿主/固氮菌種類(lèi)/文獻(xiàn)來(lái)源Host/Types of symbiotic nitrogen-fixing bacteria/Literature sources宿主/固氮菌種類(lèi)/文獻(xiàn)來(lái)源Host/Types of symbiotic nitrogen-fixing bacteria/Literature sourcesHeterotermes ferox/Enterobacter sp., Streptococcus sp.[13]Ochotona hyperborea/Bradyrhizobium sp., Bryantella formatexigens, Clos-tridium cellulovorans, DC. pasteurianum, Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes, Sphingomonas sp., Treponema sp.[101]H. indicola/Desulfovibrio termitidis[22]Ochotona dauurica, Ochotona hyperborea, Ochotona mantchurica/Bradyrhi-zobium sp., Bryantella formatexigens, Clostridium cellulovorans, Fibrobacter succinogenes, Sphingomonas sp., Treponema sp.[89]Reticulitermes lucifugus/Bacillus sp., Enterobacteriaceae, Erwinia sp., Rhodococcus sp., CStaphylococcussimulans, CS. haemolyticus[33]Meriones meridianus, M. tamariscinus/Bacillus sp., Corynebacterium sp., Enterobacteriaceae sp.[82]Reticulitermes flavipes/Desulfovibrio desulfuricans[22]Microtus rossiaemeridionalis/Arthrobacter sp., Bacillus cereus, BB. licheniformis, BCB. subtilis, Bacteroides sp., Curtobacterium sp., Mi-crococcus sp., Myxococcales, Rhodococcus sp., Staphylococcus sp. [84]Reticulitermes speratus/DClostridium pasteurianum, Desulfovibrio gigas, Methanobacterium ivanovii[94]Clethrionomys glareolus/BBacillus licheniformis, BCB. subtilis, Bacteroides sp., Enterobacteriaceae, Micrococcus sp., Myxococcales, Nocardia sp.[84]Nasutitermes exitiosus/DCitrobacter freundii, Staphylococcus sp.[13]Homo sapiens/BCEnterobacter cloacae, Klebsiella aerogenes[79]; Coprococcus catus, C. comes, Desulfitobacterium hafniense, Eubacterium hallii, E. sp., BDKlebsiella pneumoniae, Lachnospira multipara, Methylocystis sp., Megas-phaera elsdenii, Methanomassiliicoccus luminyensis, Ruminococcus obeum, Pyramidobactor piscolens, Roseburia sp.[93]

2.2 動(dòng)物共生固氮菌的生態(tài)類(lèi)型多樣性

表2所列動(dòng)物共生固氮菌種類(lèi),涵蓋植物固氮菌和自生固氮菌等多種生態(tài)類(lèi)型。其中40種曾作為植物共生固氮菌、植物內(nèi)生固氮菌、植物根際固氮菌、自生固氮菌予以報(bào)道。植物共生固氮菌6種：德式固氮根瘤菌、Bradyrhizobiumdenitrificans、慢生大豆根瘤菌、百脈根中生根瘤菌、Rhizobiumrosettiformans、苜蓿中華根瘤菌。植物內(nèi)生固氮菌7種：固氮醋桿菌、巨胞氮單胞菌、地衣芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、聚團(tuán)腸桿菌、變棲克雷伯氏菌、成團(tuán)泛菌。植物根際固氮菌8種：熱纖梭菌、溶紙莎草梭菌、酪丁酸梭菌、斯氏假單胞菌、Sphingomonasazotifigens、山羊葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、模仿葡萄球菌。自生固氮菌8種：敏捷氮單胞菌、圓褐固氮菌、棕色固氮菌、著色菌、弗氏檸檬酸桿菌、巴氏固氮梭菌、需鹽脫硫弧菌、土生拉烏爾菌。植物共生/內(nèi)生固氮菌1種,即洋蔥伯克霍爾德菌。植物內(nèi)生/根際固氮菌8種：巴西固氮螺菌、高鹽固氮螺菌、生脂固氮螺菌、甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌、陰溝腸桿菌、 植生克雷白氏菌、催娩克雷伯氏菌。植物內(nèi)生/自生固氮菌2種：巨胞氮單胞菌和肺炎克雷伯氏菌。

2.3 固氮菌的生態(tài)類(lèi)型轉(zhuǎn)換

在固氮菌中較為常見(jiàn),兼性?xún)?nèi)生固氮菌,如一些固氮螺菌屬細(xì)菌,既能在根內(nèi)也能在根表和土壤中定殖[117]。表2中洋蔥伯克霍爾德菌兼具植物共生固氮[102]和植物內(nèi)生固氮能力[118]。巨胞氮單胞菌既是胡楊的內(nèi)生固氮菌[114],又是自生固氮菌[115]。Frohlich等[70]用象白蟻Nasutitermesnigriceps腸道分離獲得的劍菌培養(yǎng)物,對(duì)12種豆科植物進(jìn)行接種試驗(yàn),在豌豆、印度田菁、葫蘆巴上均形成了根瘤,證實(shí)動(dòng)物腸道固氮菌和植物共生固氮菌之間存在生態(tài)類(lèi)型的轉(zhuǎn)化。賓氏細(xì)長(zhǎng)蟻中、后腸結(jié)合部有菌囊,菌囊外密布?xì)夤芎婉R氏管。囊內(nèi)含有伯克霍爾德菌、黃質(zhì)菌、根瘤菌、甲基桿菌、假單胞菌[51]。伯克霍爾德菌屬于植物共生和自生固氮菌,黃質(zhì)菌可營(yíng)植物內(nèi)生固氮,根瘤菌則屬于植物共生/植物內(nèi)生和自生固氮菌,甲基桿菌是植物共生固氮菌常見(jiàn)類(lèi)群,假單胞菌在植物共生/植物內(nèi)生/植物根際固氮菌中常有發(fā)現(xiàn)。上述結(jié)果表明螞蟻體內(nèi)菌囊的內(nèi)部環(huán)境似乎比固氮植物的根瘤更復(fù)雜,能包容許多固氮菌種類(lèi)。一些不能形成植物根瘤的種類(lèi),如黃質(zhì)菌,在菌囊內(nèi)也能正常發(fā)育。

3 動(dòng)物共生固氮菌的來(lái)源

但用熒光標(biāo)記的聚團(tuán)腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌飼喂地中海果蠅成蟲(chóng),在成蟲(chóng)消化道和卵表以及幼蟲(chóng)和蛹的消化道均檢出上述細(xì)菌的存在[124]。說(shuō)明腸道共生固氮菌也存在成蟲(chóng)-卵之間的垂直傳遞。Ayayee等在經(jīng)過(guò)表面滅菌處理的光肩星天牛卵內(nèi)檢測(cè)到脲酶、固氮酶基因及其轉(zhuǎn)錄活性,表明脲分解細(xì)菌和固氮菌存在通過(guò)遺傳進(jìn)行垂直傳遞的可能性[28]。

4 動(dòng)物共生菌固氮的性質(zhì)

一般認(rèn)為動(dòng)物腸道共生菌固氮屬于聯(lián)合固氮,柯為稱(chēng)白蟻腸道內(nèi)固氮菌是一種“聯(lián)合共生固氮形式”在動(dòng)物界的出現(xiàn)[125]。祁永青等則將聯(lián)合固氮菌定義為“必須生活在植物根際、葉面或動(dòng)物腸道等處才能固氮的原核生物”[126]。另外有珊瑚和固氮細(xì)菌的互作聯(lián)合固氮,如石珊瑚和固氮菌屬的聯(lián)合固氮,海洋藍(lán)藻與海綿屬形成內(nèi)共生關(guān)系,蛤類(lèi)與藍(lán)藻、固氮菌的聯(lián)合固氮[127]。此外,動(dòng)物共生固氮菌固氮活性容易受環(huán)境影響,也具有較明顯的聯(lián)合固氮特征。白蟻種類(lèi)、品級(jí)以及不同季節(jié)等均影響固氮活性,其中食物含氮量為主要影響因子,其他因子在不同程度上也可溯及食物含氮量的關(guān)系[14]。食性對(duì)固氮活性的影響一般表現(xiàn)為低等食木白蟻固氮活性強(qiáng),高等培菌白蟻和食土白蟻固氮活性弱或沒(méi)有活性[14]。在食料中添加(NH4)2SO4或KNO3均能顯著減低臺(tái)灣乳白蟻工蟻腸道共生固氮菌的固氮能力[9]。已經(jīng)分離獲得的固氮菌中,許多種類(lèi)屬于兼性厭氧菌、生境較為廣泛,似乎與白蟻構(gòu)成專(zhuān)性共生的可能性不大[14]。Vecherskii等對(duì)歐洲散白蟻共生菌固氮研究表明：活體和蟻巢物質(zhì)在好氧和厭氧條件下均有固氮酶活性,白蟻腸道內(nèi)細(xì)菌群落與蟻巢物質(zhì)的類(lèi)似[33]。因此認(rèn)為該種白蟻與共生固氮菌之間關(guān)系屬于聯(lián)合固氮作用。但也有研究表明動(dòng)物腸道有特殊的含菌構(gòu)造,如賓氏細(xì)長(zhǎng)蟻中、后腸結(jié)合部有類(lèi)似于根瘤的菌囊,囊內(nèi)含有多種固氮菌[51]。此外,固氮酶基因檢測(cè)表明,動(dòng)物腸道固氮菌區(qū)系十分豐富,能夠分離培養(yǎng)的僅為其極少部分,不能排除專(zhuān)性共生體系的存在。

5 動(dòng)物共生菌固氮的微生境與共生復(fù)合體

5.1 動(dòng)物共生菌固氮的微生境

氧氣、氫氣、pH和氧化還原電位等是腸道微生境的主要指標(biāo),在腸道不同部位這些指標(biāo)存在明顯差異,形成多樣化的微生境,供不同生理需求的固氮菌生長(zhǎng)發(fā)育。低等白蟻大多數(shù)腸道微生物位于后腸前段膨大的后腸囊內(nèi)。高等白蟻腸道區(qū)室化有逐漸復(fù)雜化的趨勢(shì),食土白蟻后腸膨大形成連續(xù)的5個(gè)囊室,相鄰囊室之間以肌肉閥瓣分隔。消化道不同部位以及不同的后腸囊內(nèi)氧氣、氫氣、pH和氧化還原電位均有差異[128]。黃肢散白蟻和象白蟻的后腸囊氧氣濃度分布呈現(xiàn)兩個(gè)不同區(qū)域,外側(cè)為微氧層,約占后腸囊體積的60%,其中生活的共生菌消耗掉向腸道內(nèi)擴(kuò)散的氧氣,形成氧阱,造成后腸囊中心部分(40%)嚴(yán)格的厭氧環(huán)境。與此相反,后腸囊中心部位氫氣濃度最高,并通過(guò)兩個(gè)區(qū)域消耗氫氣,抑制其向外擴(kuò)散。一個(gè)區(qū)域是臨近后腸囊中心部位的腸腔區(qū)域,另一個(gè)是后腸壁區(qū)域。氧氣和氫氣的上述分布特點(diǎn)使厭氧和微好氧微生物各得其所,中心部分嚴(yán)格的厭氧環(huán)境是發(fā)酵生成乙酸酯的場(chǎng)所,而乙酸酯是宿主昆蟲(chóng)的主要能源物質(zhì)[129]。具角黑艷甲成蟲(chóng)的消化道分為前腸、中腸、前后腸和后后腸4段,每段中心部位均有一個(gè)厭氧核心區(qū),由此向外氧氣含量逐漸增高。放線(xiàn)菌和根瘤菌主要分布于前腸和后后腸。前后腸內(nèi)表面腸壁細(xì)胞形態(tài)分化最大,形成密集的胞窩和棘刺,將空間進(jìn)一步區(qū)室化供細(xì)菌、原生動(dòng)物、線(xiàn)蟲(chóng)等定殖,其中擬桿菌和梭菌為主要類(lèi)群。該部位還是產(chǎn)甲烷古菌的唯一分布區(qū)域和共生菌固氮核心部位[130]。

5.2 共生復(fù)合體

固氮菌一般與多種生物形成復(fù)合體,以滿(mǎn)足固氮過(guò)程的能源和固氮產(chǎn)物同化等方面的需求。臺(tái)灣乳白蟻與后腸的偽披發(fā)蟲(chóng)Pseudotrichonymphagrassii、偽披發(fā)蟲(chóng)內(nèi)生菌Azobacteroidespseudotrichonymphae形成三重共生關(guān)系。食物通過(guò)口器和前腸粉碎、中腸消化吸收后,形成較為純粹的木質(zhì)纖維素微粒,這些微粒成為偽披發(fā)蟲(chóng)的食料,經(jīng)偽披發(fā)蟲(chóng)分解后形成能量物質(zhì),為白蟻和固氮菌利用。A.pseudotrichonymphae則主要負(fù)責(zé)固氮和氮素營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)化,為披發(fā)蟲(chóng)和白蟻提供氮素營(yíng)養(yǎng)[16]。隱尾蠊后腸內(nèi)原生動(dòng)物披發(fā)蟲(chóng)Barbulanympha體表有許多外共生的擬桿菌,這些外共生菌具有固氮能力,與隱尾蠊、披發(fā)蟲(chóng)構(gòu)成三重共生復(fù)合體[75]。豬毛菜屬的Salsolainermis為旱生植物,與錐喙象以及錐喙象腸道固氮菌肺炎克雷伯氏菌形成三重共生。象甲形成緊密附著在植物根部的土室,以此獲得碳素、水分等營(yíng)養(yǎng)并躲避敵害,肺炎克雷伯氏菌通過(guò)共生固氮提供氮素營(yíng)養(yǎng),并促進(jìn)植物生長(zhǎng)[17]。固氮菌一般與纖維素分解菌協(xié)同作用,以滿(mǎn)足各自對(duì)能量和氮素營(yíng)養(yǎng)的需求。將黑翅土白蟻腸道分離的纖維素分解菌與固氮菌混合培養(yǎng),纖維素酶活性與固氮酶活性均有顯著提高[131]。從奶牛瘤胃中分離的纖維素分解菌和固氮菌進(jìn)行混合體外發(fā)酵,混合菌株的添加對(duì)瘤胃的發(fā)酵也具有促進(jìn)作用[132]。纖維素分解和固氮也可在同一種細(xì)菌體內(nèi)完成。船蛆鰓上著生有Deshayes腺,腺體細(xì)胞內(nèi)的船蛆桿菌既可分解木質(zhì)纖維素,也可固氮[59,61]。

6 動(dòng)物共生菌固氮產(chǎn)物的同化

6.1 動(dòng)物體內(nèi)氨同化途徑

氨既是共生固氮的產(chǎn)物,對(duì)組織細(xì)胞也具有毒害作用,必須轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮素營(yíng)養(yǎng)或及時(shí)清除。氨轉(zhuǎn)化為含氮有機(jī)物主要有4種途徑：(1)谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)途徑：氨與谷氨酸(Glu)在GS催化下生成谷氨酰胺(Gln),Gln在GOGAT催化下將氨基轉(zhuǎn)移給α-酮戊二酸,生成2分子Glu。GS有3類(lèi)：GSⅠ主要存在于細(xì)菌；GSⅡ主要存在于植物共生細(xì)菌以及真核細(xì)胞中；GSⅢ發(fā)現(xiàn)于專(zhuān)性厭氧桿菌、一些厭氧細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌。GS/GOGAT對(duì)氨的親和性高,主要在低氨濃度時(shí)發(fā)揮作用。(2)谷氨酸脫氫酶(GDH)途徑：氨與α-酮戊二酸在GDH催化下生成Glu。GDH有兩種,NAD-GDH降解谷氨酸,NADP-GDH用于谷氨酸的合成。GDH在高氨濃度時(shí)占主導(dǎo)作用。(3)丙氨酸脫氫酶(ADH)途徑：ADH催化丙酮酸和銨生成丙氨酸；(4)天冬氨酸酶途徑：催化延胡索酸和銨生成天冬氨酸[133]。

6.2 反芻動(dòng)物瘤胃氨的同化

主要由細(xì)菌和真菌完成,瘤胃細(xì)菌可分為發(fā)酵結(jié)構(gòu)性碳水化合物和發(fā)酵非結(jié)構(gòu)性碳水化合物兩類(lèi),前者僅能利用氨作為氮源,后者則可利用氨、氨基酸和肽作為氮源。結(jié)構(gòu)性碳水化合物主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。瘤胃纖維分解菌對(duì)氨氮的利用主要是通過(guò)GDH和ADH途徑。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物包括水溶性碳水化合物,如單糖、雙糖、低聚糖和一些多糖,以及不溶于水的大分子多糖。非纖維分解菌對(duì)氨氮的利用主要是通過(guò)GDH路徑和GS路徑,可以從頭合成多種自身所需氨基酸,且大多數(shù)不存在GOGAT路徑。瘤胃厭氧真菌缺乏蛋白質(zhì)降解能力,可以以氨為唯一氮源合成自身所需氨基酸滿(mǎn)足生長(zhǎng)需求。GDH和GS-GOGAT途徑是瘤胃真菌同化氨的2條主要路徑[133]。

6.3 珊瑚體內(nèi)氨的同化

珊瑚對(duì)氨的同化由腸壁細(xì)胞與蟲(chóng)黃藻協(xié)同完成,蟲(chóng)黃藻位于珊瑚腸壁細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi),能通過(guò)光合作用為珊瑚提供能量,還能通過(guò)GS/GOGAT途徑將氨轉(zhuǎn)化為氨基酸(見(jiàn)圖1)。環(huán)境中的氨經(jīng)珊瑚腸腔進(jìn)入腸壁細(xì)胞質(zhì),再進(jìn)入蟲(chóng)黃藻細(xì)胞質(zhì),通過(guò)GS/GOGAT途徑轉(zhuǎn)化為Gln和Glu。所形成的Gln、Glu可以直接轉(zhuǎn)移進(jìn)入珊瑚腸壁細(xì)胞質(zhì),進(jìn)而轉(zhuǎn)化為其他氨基酸,合成蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)代謝形成的氨又可擴(kuò)散進(jìn)入腸腔,再次吸收利用或排出體外。腸壁細(xì)胞質(zhì)也存在GS/GOGAT途徑和GDH途徑,但轉(zhuǎn)化速率明顯低于蟲(chóng)黃藻共生體[135]。

圖1 珊瑚-蟲(chóng)黃藻共生體氨同化吸收模型[135]Fig.1 Model of ammonium assimilation in the coral-dinoflagellate symbiosis

6.4 白蟻體內(nèi)纖維素分解、生物固氮與氨同化

6.4.1臺(tái)灣乳白蟻-偽披發(fā)蟲(chóng)-內(nèi)生菌復(fù)合體

臺(tái)灣乳白蟻后腸有原生動(dòng)物偽披發(fā)蟲(chóng)Pseudotrichonymphagrassii,偽披發(fā)蟲(chóng)有內(nèi)生菌Azobacteroidespseudotrichonymphae。后腸內(nèi)的木質(zhì)纖維素顆粒被偽披發(fā)蟲(chóng)吞噬,降解為葡萄糖、木糖、糖醛酸等,進(jìn)一步發(fā)酵形成CO2和H2,降解產(chǎn)物從批發(fā)蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)入腸腔,在產(chǎn)酸菌作用下形成乙酸酯,成為能量物質(zhì)。內(nèi)生菌則發(fā)揮固氮和氮轉(zhuǎn)化功能。披發(fā)蟲(chóng)細(xì)胞本身缺乏脲酶和GS,固氮形成的氨必須在內(nèi)生菌體內(nèi)GS催化下生成Gln,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為其他氨基酸和輔因子。菌體內(nèi)形成的氨基酸進(jìn)入披發(fā)蟲(chóng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行含氮有機(jī)物轉(zhuǎn)化,所形成的脲和氨再進(jìn)入菌體內(nèi)進(jìn)行Gln和氨基酸合成(圖2)[16]

圖2 臺(tái)灣乳白蟻-偽披發(fā)蟲(chóng)-內(nèi)生菌復(fù)合體共生作用模型[134]Fig.2 Model of symbiosis among Coptotermes formosanus, Pseudotrichonympha grassii and its endosymbiotic bacteria

6.4.2棲北散白蟻-固氮菌-披發(fā)蟲(chóng)-白蟻菌群-1(TG1)復(fù)合體

棲北散白蟻后腸內(nèi)有原生動(dòng)物披發(fā)蟲(chóng)Trichonymphaagilis,披發(fā)蟲(chóng)內(nèi)生菌為白蟻菌群1(TG1),后腸腸腔內(nèi)還有共生固氮菌。木質(zhì)纖維素顆粒在披發(fā)蟲(chóng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分解形成葡萄糖- 6-磷酸等碳水化合物,并形成CO2、H2、乙酸酯等代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物進(jìn)入腸腔,在產(chǎn)酸菌作用下形成乙酸酯。腸腔內(nèi)固氮菌形成的氨,可以被披發(fā)蟲(chóng)吸收,經(jīng)過(guò)GS途徑合成Gln后進(jìn)入TG1菌體內(nèi),轉(zhuǎn)化為氨基酸和輔因子(見(jiàn)圖3)。后腸腸腔內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物、披發(fā)蟲(chóng)、細(xì)菌組成的營(yíng)養(yǎng)液,可能通過(guò)肛交哺和糞食性,被蟻巢內(nèi)不同個(gè)體分享[136]。

圖3 棲北散白蟻-固氮菌-披發(fā)蟲(chóng)-白蟻菌群- 1(TG1)復(fù)合體共生作用模型[136]Fig.3 Model of symbiosis among Reticulitermes speratus, symbiotic nitrogen-fixing bacteria, Trichonympha agilis and TG1

6.4.3白蟻共生菌固氮產(chǎn)物的吸收路徑

Bentley用15N2作為氮源培養(yǎng)Nusutitermescorniger工蟻和兵蟻,24h后分別檢測(cè)腸道、頭部、蟲(chóng)體其他部分固氮產(chǎn)物含量,發(fā)現(xiàn)三類(lèi)樣品中均有固氮產(chǎn)物檢出,證實(shí)了共生菌固氮與產(chǎn)物同化現(xiàn)象[64]。不同部位固氮產(chǎn)物含量：工蟻為腸道>蟲(chóng)體其他部分>頭部,兵蟻為腸道>頭部>蟲(chóng)體其他部分。腸道為固氮產(chǎn)物的最初形成場(chǎng)所,固氮產(chǎn)物可以通過(guò)交哺在工蟻和兵蟻個(gè)體間轉(zhuǎn)移,從工蟻向兵蟻的轉(zhuǎn)移為主流方向。Fujita 等對(duì)棲北散白蟻的研究表明：溶菌酶活性主要分布于唾腺,前腸的溶菌酶來(lái)源于唾腺[137]。蛋白酶活性和游離氨基酸含量中腸最高。推測(cè)棲北散白蟻通過(guò)唾腺分泌的溶菌酶分解肛交哺獲得的含菌后腸液,而溶菌酶進(jìn)入中腸后被中腸蛋白酶分解失活,在后腸中活性很低,對(duì)后腸共生菌群較安全。此后,Fujita 等采用15N2示蹤對(duì)棲北散白蟻生物固氮產(chǎn)物同化途徑進(jìn)行研究,固氮產(chǎn)物主要出現(xiàn)在后腸,其次為嗉囊與中腸,在頭部以及蟲(chóng)體其他部分也有檢出[36]。后腸、嗉囊與中腸內(nèi)固氮產(chǎn)物首先出現(xiàn),一段時(shí)間后,頭部和蟲(chóng)體其他部分也出現(xiàn)固氮產(chǎn)物的蹤跡。據(jù)此認(rèn)為,大部分固氮產(chǎn)物的同化吸收并不是在后腸完成的,而是通過(guò)肛交哺轉(zhuǎn)移到前腸,在前腸和中腸完成酶解和吸收過(guò)程。

7 共生菌固氮在動(dòng)物氮素營(yíng)養(yǎng)中的地位

動(dòng)物氮素營(yíng)養(yǎng)可以來(lái)自于食物、非蛋白氮以及共生菌固氮,其中非蛋白氮指氮素營(yíng)養(yǎng)代謝形成的產(chǎn)物,如尿素及其衍生物、氨及銨鹽、酰胺化合物等,非蛋白氮?jiǎng)游锊荒苤苯永?但可作為共生菌的氮源,經(jīng)共生菌轉(zhuǎn)化后再次為動(dòng)物利用。反芻動(dòng)物的尿素在瘤胃中被細(xì)菌脲酶迅速水解成氨,部分氨參與瘤胃內(nèi)微生物蛋白的合成,最終成為動(dòng)物的氨基酸營(yíng)養(yǎng)。另部分氨經(jīng)由瘤胃擴(kuò)散進(jìn)入靜脈,隨血液在肝臟處經(jīng)鳥(niǎo)氨酸循環(huán)再次合成尿素。肝臟合成的尿素被稱(chēng)作內(nèi)源尿素,部分內(nèi)源尿素可經(jīng)由唾液或者血液再次返回到瘤胃內(nèi),被瘤胃細(xì)菌重新利用[139-140]。

鱗翅目、雙翅目、脈翅目等全變態(tài)昆蟲(chóng),在老熟幼蟲(chóng)、預(yù)蛹或預(yù)成蟲(chóng)階段,則通過(guò)臨時(shí)貯存非蛋白氮,將其轉(zhuǎn)化為氨,合成新的氨基酸和蛋白質(zhì)以滿(mǎn)足結(jié)繭等特殊行為的需求[140-141]。棲北散白蟻將尿酸貯存在脂肪體尿鹽細(xì)胞內(nèi),需要?jiǎng)佑脮r(shí),尿鹽釋入血淋巴,被馬氏管攝取后排泄進(jìn)入后腸腔,在后腸共生細(xì)菌作用下分解為氨,通過(guò)氨的同化進(jìn)入氮素營(yíng)養(yǎng)循環(huán)[142]。

氨不僅對(duì)生物固氮具有氨阻遏效應(yīng),對(duì)細(xì)胞還具有毒性,動(dòng)物體內(nèi)氮素代謝涉及營(yíng)養(yǎng)和解毒等許多方面。通過(guò)食物氮、非蛋白氮以及生物固氮相互協(xié)調(diào),形成營(yíng)養(yǎng)和解毒的代謝網(wǎng)絡(luò),共同維持動(dòng)物體內(nèi)氮素營(yíng)養(yǎng)的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)食物中蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)豐富,非蛋白氮代謝產(chǎn)物含量高,動(dòng)物體以解毒排泄為主,非蛋白氮的再利用以及生物固氮處于抑制狀態(tài)；貧氮營(yíng)養(yǎng)型動(dòng)物,則通過(guò)非蛋白氮的循環(huán)利用和生物固氮,補(bǔ)充食物中氮素營(yíng)養(yǎng)的不足。這些貧氮營(yíng)養(yǎng)型動(dòng)物,如白蟻、珊瑚、食草動(dòng)物等,一般具有較高的共生菌固氮活性。生物固氮需要消耗很多能量,大量能源物質(zhì)應(yīng)用于氮素營(yíng)養(yǎng)的合成,勢(shì)必影響動(dòng)物體內(nèi)的能量權(quán)衡。因此,即使是具有共生菌固氮能力的白蟻,也依然對(duì)富氮營(yíng)養(yǎng)食物表現(xiàn)出較強(qiáng)的趨性。取食含氮量高的食物時(shí),體內(nèi)共生固氮量下降[65]。

8 結(jié)語(yǔ)

一般認(rèn)為,動(dòng)物的共生菌固氮主要存在于貧氮營(yíng)養(yǎng)型動(dòng)物,但現(xiàn)有報(bào)道涉及的動(dòng)物達(dá)到7門(mén)13綱23目50科99屬174種,已遠(yuǎn)超上述范圍。從海綿到人類(lèi),涉及低等到高等多種動(dòng)物類(lèi)群。雖然其中有些種類(lèi)僅為固氮酶基因檢出的結(jié)果,這些基因表達(dá)情況還有待進(jìn)一步確認(rèn),但共生菌固氮可能是動(dòng)物中普遍存在的現(xiàn)象。所涉及的固氮菌類(lèi)群也十分豐富,其中大多數(shù)種類(lèi)為細(xì)菌,也有少數(shù)古菌和藻類(lèi)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物共生固氮菌種類(lèi)與植物固氮菌具有明顯的交叉性,植物共生固氮菌、植物內(nèi)生固氮菌、植物根際固氮菌和自生固氮菌在不同動(dòng)物腸道內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)。這些情況似乎表明生物固氮可能具有統(tǒng)一的固氮菌資源庫(kù),同一種固氮菌與植物共生、與動(dòng)物共生或者自由生活,只是固氮菌對(duì)生境的選擇,取決于環(huán)境條件是否能滿(mǎn)足特定固氮菌固氮活性表達(dá)的需要。如電子和質(zhì)子供體、能量供給、固氮酶活性保護(hù)以及解除氨阻遏等。這也表明動(dòng)物腸道具有豐富的微生境,能滿(mǎn)足不同固氮菌的生理需求。動(dòng)物共生固氮菌將會(huì)成為生物固氮資源開(kāi)發(fā)的富礦,在生物固氮研究、發(fā)酵工業(yè)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)等領(lǐng)域展示其重要價(jià)值。

分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,對(duì)動(dòng)物共生固氮研究發(fā)揮了很大的促進(jìn)作用。但所發(fā)現(xiàn)的固氮菌資源以及固氮機(jī)理的理論模型,與具體情況的解釋驗(yàn)證還有相當(dāng)距離。動(dòng)物共生菌固氮過(guò)程一般由多種動(dòng)物和細(xì)菌組成的復(fù)合體,分別完成電子和質(zhì)子提供、能量保障、氧阱形成以及氨的同化等任務(wù)。目前對(duì)這些過(guò)程基本上還不了解。動(dòng)物共生固氮、植物共生固氮、自生固氮在固氮產(chǎn)物氨的同化方面均采用GS/GOGAT、GDH和ADH等途徑,但不同生物體內(nèi)相關(guān)途徑的酶系來(lái)源存在較大差異。動(dòng)物體內(nèi)氨同化酶系是否完全源于共生菌？酶系來(lái)源差異影響動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝的機(jī)制如何等等,也是動(dòng)物共生固氮機(jī)理研究的基本問(wèn)題。此外,動(dòng)物共生菌固氮的性質(zhì)也需要研究確認(rèn)。總體上,動(dòng)物通過(guò)食物攝取、非蛋白氮排泄或循環(huán)利用以及共生菌固氮等途徑,維持體內(nèi)氮素營(yíng)養(yǎng)的平衡和氮素代謝末端產(chǎn)物的降解排泄,隨著研究的深入,將進(jìn)一步加深人們對(duì)氮素資源利用和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理等方面的理解。