果酒殘渣廢液發(fā)酵生化黃腐酸的菌種篩選

楊 輝， 董騰達， 黃莎莎， 蘇 文， 王麗紅， 趙 敏， 王婷婷

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

黃腐酸(Fulvic Acid)，又叫富里酸，作為腐殖酸的組分之一，由于其具有分子量小，活性基團含量高，官能團種類豐富的特點，使得黃腐酸具有生理活性大、抗絮凝能力強、離子交換能力強、易溶于水等特性[1,2].黃腐酸在農業(yè)上的應用廣泛，隨著科研不斷深入，黃腐酸在林業(yè)、工業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥等其他領域也有諸多應用[3].早期的黃腐酸分離提取基于煤炭，產(chǎn)物稱為礦源黃腐酸(MFA).后來，研究人員發(fā)現(xiàn)以農副產(chǎn)物為原料，人為控制發(fā)酵條件，通過微生物的腐殖轉化作用，生產(chǎn)出的黃腐酸比礦源黃腐酸具有更強的生理活性、水溶性、抗絮凝等能力[4]，稱為生化黃腐酸(BFA).

發(fā)酵制備BFA多以固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵為主，固態(tài)發(fā)酵具有原料易得、投資較低、工藝簡單等特點[5]，液態(tài)發(fā)酵制備BFA的研究比較少，具有時間短、高轉化率、機械化程度高等特點，但是其成本較高.本試驗采用液-固混合的發(fā)酵方式，優(yōu)勢在于發(fā)酵結束后對發(fā)酵物進行固液分離，固體作為有機肥料，液體既能當作液肥直接使用，又可濃縮為黃腐酸[6]，能使果酒發(fā)酵廢棄物得到高值化的充分利用.

蒸餾醪液和果渣均為工業(yè)生產(chǎn)中的下腳料，每年在我國排放量大，目前綜合利用不足，造成環(huán)境污染和資源浪費.果渣中含有豐富的纖維素、蛋白質、糖類等營養(yǎng)物質.蒸餾醪液中含有大量氨基酸、無機鹽、糖類等有機質，營養(yǎng)價值豐富，是轉化腐殖酸的重要營養(yǎng)物質，并且蒸餾醪液含有酵母發(fā)酵產(chǎn)物，其中不乏BFA成分，但還有大量有機質未被轉化成BFA[7].

腐殖酸形成的微生物學說表明，多種微生物聯(lián)合作用是腐殖酸形成的前提[8,9].因此，本試驗以海紅果酒生產(chǎn)廢棄物為主原料，采用液-固混合發(fā)酵方式，對BFA發(fā)酵的關鍵即微生物的篩選進行了探究，企圖篩選高產(chǎn)BFA的菌種，增加BFA的產(chǎn)量，旨在為實現(xiàn)果渣和海紅果白蘭地蒸餾醪液的高價值利用提供新途徑，同時為其他果酒產(chǎn)生的廢棄物的綜合利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

海紅果渣、海紅果白蘭地蒸餾醪液(可溶性固形物含量為28%，BFA含量為18.84%)，府谷縣聚金邦農產(chǎn)品開發(fā)公司；蘋果渣，陜西藍海果業(yè)有限公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉,北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉、重鉻酸鉀、1,10-菲啰啉、硫酸亞鐵銨,天津市科密歐化學試劑有限公司.

1.1.2 儀器與設備

PHS-3C型pH計,上海儀電科學器股份有限公司；WMK-08恒溫培養(yǎng)箱,山東濰坊醫(yī)療器械廠；HWY-100B恒溫培養(yǎng)搖床,上海智城分析儀器制造有限公司.

1.1.3 實驗菌種

克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)、保拉迪酵母(Saccharomycesboulardi)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、綠色木霉(Trichodermaviride)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)，均為本實驗室提供.

1.1.4 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基：細菌培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)、霉菌培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)、酵母培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基).

(2)搖瓶培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基去掉瓊脂部分.

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：將海紅果蒸餾醪液用氨水調整pH至6.0，取50 mL加入250 mL錐形瓶中，然后加入海紅果渣(40 g/L)和蘋果渣(20 g/L).

1.2 方法

1.2.1 菌種活化和培養(yǎng)

將1.1.3菌種分別在平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，控制酵母生長溫度28 ℃，培養(yǎng)48±2 h；細菌生長溫度32 ℃，培養(yǎng)48±2 h.然后取一環(huán)活化后的酵母和細菌分別接種于搖瓶培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，酵母在28 ℃培養(yǎng)24～28 h，轉速為150 r/min；細菌在32 ℃培養(yǎng)25～30 h，轉速150 r/min.控制孢子濃度達到1×108個/mL.

控制霉菌生長溫度30 ℃，平板培養(yǎng)72±2 h后，用10 mL無菌水將孢子洗下，充分震蕩分散孢子，然后加入搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～15 h，控制其孢子濃度為1×108個/mL[10,11].各菌液鏡檢無雜菌污染后即可作為本試驗的發(fā)酵菌劑.

1.2.2 單菌發(fā)酵試驗

將1.2.1擴大培養(yǎng)好的七個菌種以4%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30 ℃，pH 6.0，轉速150 r/min的條件下發(fā)酵4 d后，分別測定BFA含量，與原醪液中BFA含量形成對照，篩選出高產(chǎn)BFA的菌種.各處理重復三次，結果取平均值.

1.2.3 混菌發(fā)酵試驗

將1.2.2篩選出的優(yōu)勢菌種混合，以4%的總接種量進行雙菌、三菌和四菌混合發(fā)酵(各菌種等比例接種)，發(fā)酵條件：溫度30 ℃，pH 6.0，轉速150 r/min，發(fā)酵4 d后，分別測定各組混合發(fā)酵液的BFA含量，與原醪液中BFA含量進行對照，篩選出高產(chǎn)BFA的菌種組合.各處理重復三次，結果取平均值.

1.2.4 菌種配比的確定

將1.2.3篩選出的高產(chǎn)BFA的適宜組合,按表1設計菌種配比進行發(fā)酵試驗，各組以4%的總接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在pH 6.0，轉速150 r/min，溫度 30 ℃條件下發(fā)酵，每天測定各組發(fā)酵液的BFA含量和pH，確定菌種最優(yōu)配比.各處理重復三次，結果取平均值.

表1 微生物接種方案

1.2.5 測定方法

(1)黃腐酸測定用重鉻酸鉀容量法[12].

(2)溫度測定用溫度計進行測定.

(3)發(fā)酵物pH值使用pH計測定.

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0和Origin8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析.采用LSD法對各處理間的差異進行多重比較.

2 結果與討論

2.1 BFA單菌發(fā)酵試驗

根據(jù)腐殖酸形成的微生物學說，將實驗室保存的七種菌株經(jīng)液體活化培養(yǎng)后，以4%的量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中按設計條件發(fā)酵，各菌種發(fā)酵液中BFA含量如圖1所示.

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著；不同大寫字母表示菌種：K，克勒克酵母；B，保拉迪酵母；I，東方伊薩酵母；S，釀酒酵母；A，黑曲霉；T，綠色木霉；D，短短芽孢桿菌；CK表示原醪液.圖1 菌種對發(fā)酵液BFA含量的影響

結果表明：綠色木霉(T)的發(fā)酵力最強，其發(fā)酵液中BFA含量高達23.68%，相比原醪液BFA含量提高4.84%，且顯著高于其他菌株的BFA含量(p<0.05).接種克勒克酵母(K)的發(fā)酵液中，BFA含量為22.62%，相比原醪液BFA含量提高3.78%.接種東方伊薩酵母(I)、短短芽孢桿菌(D)和保拉迪酵母(B)的發(fā)酵液中BFA含量較低，比原醪液BFA含量的增加量均小于2%.

出現(xiàn)上述結果的原因在于綠色木霉環(huán)境適應能力強，營養(yǎng)需求簡單，它與黑曲霉都可以分泌多種纖維素胞外酶，具有較強的纖維素降解能力[13].克勒克酵母相比釀酒酵母可以產(chǎn)生更多種類的胞外酶，其中就包括β-葡聚糖酶(β-glucanase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)等纖維素酶，這些胞外酶促進克勒克酵母對多種有機物代謝利用，比釀酒酵母產(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物[14].本試驗中,具有纖維素降解能力的微生物將醪液中的有機質代謝成為黃腐酸類物質的同時，分泌胞外酶將果渣中的纖維素、糖類等其他有機質轉化成為黃腐酸類物質，使得發(fā)酵液中的BFA含量升高.

綜上所述，選擇綠色木霉(T)、黑曲霉(A)、克勒克酵母(K)、釀酒酵母(S)為BFA發(fā)酵的良好菌種，以此進行下一步試驗.

2.2 混菌發(fā)酵產(chǎn)BFA試驗

根據(jù)單菌發(fā)酵的試驗結果，將優(yōu)勢菌種黑曲霉(A)、綠色木霉(T)、克勒克酵母(K)和釀酒酵母(S)經(jīng)液體活化培養(yǎng)后，等比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行混菌發(fā)酵試驗，發(fā)酵條件如1.2.3所示，各組合發(fā)酵液中BFA含量測定結果如圖2所示.

結果表明：三菌組合發(fā)酵液中的BFA含量并不都高于雙菌組合，且四菌組合(ATSK)BFA含量低于部分三菌組合，這與劉陶[15]的研究結果不一致，原因可能是本試驗中所選菌種的差異而造成的.在腐殖酸形成過程中，當一種微生物的代謝物成為另一種微生物的營養(yǎng)物質的時候，或者說前者可以通過代謝作用消除環(huán)境對后者的抑制作用，這說明多種微生物在體系中和諧共生，通過復雜的代謝作用從而提高了生產(chǎn)效率.

本實驗中，三菌組合(ATK和ATS)發(fā)酵液中BFA含量明顯高于雙菌組合，這說明這兩個組合的菌種協(xié)同生長，使得微生物代謝力增強，進而提高BFA的產(chǎn)率，其中三菌組合(ATK)即接種黑曲霉、綠色木霉和克勒克酵母的發(fā)酵液中的BFA含量最高，達到27.82%，較原醪液中BFA含量提高了8.98%.雙菌組合(SK)即接種克勒克酵母和釀酒酵母的發(fā)酵液中的BFA含量最低，只有21.31%，僅比原醪液中BFA含量提高2.47%. 同時，本試驗發(fā)現(xiàn)BFA含量異常的菌種組合都同時含有釀酒酵母和克勒克酵母，這可能是釀酒酵母和克勒克酵母之間存在抑制作用，阻礙了菌株生長代謝，造成BFA產(chǎn)量降低，其具體原因有待進一步研究.

因此，選擇黑曲霉、綠色木霉和克勒克酵母進行菌種配比優(yōu)化試驗.

2.3 菌種配比的確定

對上述試驗篩選出的黑曲霉、綠色木霉和克勒克酵母按照1.2.4中試驗所設計的方案進行發(fā)酵，每天測定pH值和BFA含量，確定菌種最優(yōu)配比.

2.3.1 菌種配比對pH的影響

pH值(即發(fā)酵液酸度)是影響發(fā)酵過程和最終產(chǎn)率的關鍵因素之一.pH值的變化會通過影響菌種細胞膜上電荷的變化來影響菌種的新陳代謝能力.酵母和霉菌適宜在中性或者偏酸性的環(huán)境中生長代謝，pH過高或過低，都會影響最終BFA的產(chǎn)量.

圖3給出了不同菌種配比對發(fā)酵液pH含量的影響，結果顯示發(fā)酵初期，各菌種在營養(yǎng)充足的條件下快速繁殖，兩種霉菌充分利用醪液和果渣中的有機物質，產(chǎn)生糖、氨類等代謝物使得發(fā)酵液pH上升，隨著發(fā)酵的進行，酵母代謝產(chǎn)生多種有機酸等其他產(chǎn)物使得發(fā)酵液的pH下降.從圖3中可以看出各組合的pH變化都呈先上升后下降的趨勢.組合4的克勒克酵母接種比例增大，使得其在發(fā)酵液中生長代謝能力增強，pH值下降時間早于其他組合.研究人員發(fā)現(xiàn)，由固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)BFA的pH值變化量較大[16]，由于本試驗的發(fā)酵基質主要是液體，各菌種組合pH值的變化量最大僅為0.9.而對照組由于無任何菌種接入，在整個發(fā)酵過程中pH無明顯變化.

2.3.2 菌種配比對BFA產(chǎn)量的影響

目前，關于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)BFA的工藝已比較成熟，根據(jù)溫度變化大致分為升溫、高溫、降溫和腐熟四個階段[17].可見，研究發(fā)酵過程中溫度的變化對分析微生物發(fā)酵BFA產(chǎn)量的影響非常重要.本試驗發(fā)酵基質主要為液體，經(jīng)測量發(fā)現(xiàn)，各組合溫度變化不明顯，這可能是受30 ℃恒溫環(huán)境影響而造成的，之后試驗中應進一步探討溫度的變化趨勢.

菌種配比對發(fā)酵液BFA含量的影響如圖4所示，對照組在整個發(fā)酵過程中BFA含量無明顯變化.各試驗組都呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢.發(fā)酵前三天，各菌種在營養(yǎng)充足的條件下迅速繁殖代謝，這一階段霉菌的生長占優(yōu)勢，通過消耗大量有機質使得發(fā)酵液的pH上升的同時，BFA含量持續(xù)上升.發(fā)酵第三天到第四天，組合4的BFA含量繼續(xù)快速增長，其它組合BFA含量增速放緩，這可能與組合4中克勒克酵母接種比例增大有關. 克勒克酵母除了代謝產(chǎn)生脂類、酸類等物質外，還具有很強的分泌胞外酶的能力，其中分泌β-葡萄糖苷酶的能力較強[18].混菌發(fā)酵可以提高纖維素酶活，也可以改變酶系組分的配比，從而使得纖維素酶的酶解能力提高[19].當克勒克酵母、綠色木霉和黑曲霉混合發(fā)酵，可能是通過優(yōu)化三類纖維素酶的配比，提高酶活，進而促進對發(fā)酵基質的分解利用，使得發(fā)酵液中BFA含量提高.發(fā)酵四天后，各菌種組合的BFA含量變化不顯著，原因可能是發(fā)酵液中生化黃腐酸的轉化已基本結束，這時候發(fā)酵培養(yǎng)基中只剩下木質素、水不溶纖維等難以分解的物質.最后各種物質轉化過程達到平衡，各組的BFA含量恒定且高于對照組，其中組合4的BFA含量高達30.21%，顯著高于其他菌種組合(p<0.05).

因此，選擇組合4為最優(yōu)菌種配比，即黑曲霉、綠色木霉和克勒克酵母的接種比例為1∶1∶2，此時發(fā)酵液BFA含量為30.21%.

圖4 菌種配比對BFA含量的影響

3 結論

(1)采用液-固混合發(fā)酵方式對高產(chǎn)BFA的菌種進行了篩選配比.結果表明，單一菌種發(fā)酵時綠色木霉的發(fā)酵力最強，其發(fā)酵液中BFA含量高達23.68%，相比原醪液BFA含量提高4.84%；

(2)當混合菌種中同時含有釀酒酵母和克勒克酵母時，會出現(xiàn)抑制作用，使得發(fā)酵液中BFA產(chǎn)量降低；

(3)增加克勒克酵母的接種比例即黑曲霉:綠色木霉:克勒克酵母為1∶1∶2時，發(fā)酵液的BFA含量高達30.21%，相比原醪液BFA含量提高了11.37%.本研究充分說明多菌種的適當混合發(fā)酵可以顯著增加BFA的產(chǎn)量.

不同的菌種其生長、發(fā)酵適宜條件不同，混合菌種發(fā)酵時應注意不同菌種發(fā)酵條件之間的協(xié)調平衡才能取得更高的發(fā)酵效率，對此后續(xù)將進行詳細研究.