無花果酒的發(fā)酵工藝及其抗氧化活性分析

馬艷弘，金秋瓊，崔晉，曹培杰，田麗敏，黃開紅

(1.江蘇省農業(yè)科學院 農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.蘇州西山國家現代農業(yè)示范園區(qū)有限責任公司，江蘇 蘇州 215111)

無花果(FicuscaricaL.)隸屬桑科無花果屬，其果汁香氣濃郁、酸甜適口[1]，既含有豐富的維生素、礦質元素、氨基酸等，還含有多酚、黃酮、活性多糖、超氧化物歧化酶(SOD)、呋喃香豆素內酯等生物活性物質[2，3]，具有免疫調節(jié)、保護心血管、降血脂、抗衰老等多重藥理保健功效[4～6]，具有廣闊的市場發(fā)展前景。

由于無花果不耐儲運，每年都有大量果實在盛果期爛在田頭、攤位，給果農造成很大的經濟損失，嚴重制約了其產業(yè)發(fā)展。在無花果加工領域，果酒加工技術途徑低碳高效、幾乎可保留其所有的營養(yǎng)成分，是最有發(fā)展前景的加工技術途徑。鄧星星等通過ITS序列分析，鑒定出菌株SUYX-03屬于酵母屬中的釀酒酵母，由發(fā)酵試驗得出該酵母菌是適合無花果果酒制作的優(yōu)良的釀酒酵母[7]；蔣成等通過主成分分析研究不同酵母與有機酸之間的相關性，發(fā)現與菌株KD密切相關的有機酸種類最多[8]；JustynaPotka-Wasylka等通過選擇參數包括pH值、酒精含量和發(fā)酵溫度的應用程序對無花果酒的發(fā)酵程序進行了最優(yōu)化分析與評估[9]。迄今為止，多數有關無花果酒的研究仍主要集中在簡單加工方面，相關產業(yè)化生產工藝、活性因子檢測及抗氧化活性等方面仍亟需進一步深入研究。本研究通過酵母菌發(fā)酵制備無花果酒，并通過單因素試驗和響應面分析法優(yōu)化無花果酒的最佳發(fā)酵工藝并考察維生素C、多酚、黃酮等主要的功能因子及其體外抗氧化活性，旨在為無花果酒的產業(yè)化生產提供理論依據和技術參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

布萊瑞克無花果：由蘇州西山國家農業(yè)示范有限責任公司提供，品種為“瑪斯義陶芬”，八成熟。

釀酒酵母：酵母菌RV171、RV002、BV181、PHYT，安琪酵母股份有限公司。

纖維素酶(活力≥10 000 U·mg-1)、果膠酶(活力≥30 000 U·g-1)：合肥Biosharp生物科技有限公司；福林酚：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：南京藤春生物科技發(fā)展有限公司；維生素C檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

電子天平(PL303型)：梅特勒-托利多(上海)有限公司；打漿機(MJ-BL15U11型)：廣東美的生活電器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋(DK-8D型)：上海精宏實驗設備有限公司；紫外可見分光光度計(D-8型)：上海奧析科學儀器有限公司；漩渦混合儀(XW-80 A型)：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 無花果酒制備工藝

無花果清洗干凈后用打漿機破碎榨汁，加入1.56%的纖維素酶和0.28%的果膠酶，于53 ℃條件下酶解90 min，酶解結束后將果漿糖度調節(jié)至20%，再添加SO2(K2S2O5)混合均勻，然后接種釀酒酵母發(fā)酵劑保溫發(fā)酵，發(fā)酵結束后用板框壓濾機進行渣液分離，清酒經澄清處理后依次經硅藻土過濾、膜過濾后灌裝，即為成品。

1.3.2 菌種的活化

將釀酒干酵母粉按照1：20(g·mL-1)的質量體積比與4%的葡萄糖溶液混合均勻，在35～37 ℃條件下保溫培養(yǎng)20～30 min，即得酵母菌發(fā)酵劑。

1.3.3 酵母菌的選擇

無花果經打漿酶解后，添加80 mg·kg-1SO2，再按照0.04%的接種量分別接種活化的酵母菌RV171、RV002、BV181、PHYT，在25 ℃條件下發(fā)酵10 d，經渣液分離、澄清處理后檢測無花果酒的酒精度和維生素C含量，根據結果確定適宜的發(fā)酵菌種。

1.3.4 無花果酒發(fā)酵工藝單因素試驗

在確定適宜發(fā)酵菌種的基礎上，分別考察酵母接種量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)，SO2添加量(25、45、65、85、105、125 mg·kg-1)，發(fā)酵溫度(24、26、28、30、32、34 ℃)，發(fā)酵時間(0、2、4、6、8、10`、12 d)對無花果酒酒精度的影響，根據結果確定適宜的發(fā)酵條件。

1.3.5 無花果酒發(fā)酵工藝響應面優(yōu)化試驗

根據單因素試驗結果，以SO2添加量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為試驗因素，以酒精度為響應值，采用Box-benhnken中心組合設計，根據Design-Expert 8.05軟件優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3.6 無花果酒體外抗氧化活性檢測

分別取1 mL 無花果酒液，參考馬艷弘等[10]的方法加入不同反應劑，根據517 nm處吸光度計算DPPH自由基清除率；按照徐靜珠等[11]的方法加入不同反應劑，根據其550 nm處的吸光值計算羥自由基清除率。

1.3.7 指標檢測

酒精度參照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；總多酚含量采用福林-酚法測定[9]，標準曲線回歸方程為：y=0.010 9x+0.002 1(R2=0.999 1)；總黃酮采用蘆丁-AlNO3法測定[12，13]，標準曲線方程為：y=9.74x-0.005 3(R2=0.999 4)：維生素C按照南京建成生物工程研究所維生素C測定試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計分析

利用SPSS18.0和Design-Expert 8.05數據處理軟件進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母菌種的確定

考察不同釀酒酵母對無花果酒的酒精度和維生素C含量的影響，從圖1可以得出，采用釀酒酵母RV171發(fā)酵的無花果酒中酒精度最高，達12.8% vol；維生素C含量也最高，達173.52 mg·L-1，其次為酵母菌PHYT，酒精度和維生素C含量分別11.5% vol和173.24 mg·L-1，釀酒酵母RV818發(fā)酵的無花果酒其酒精度和維生素C含量均最低。因此確定酵母菌RV171為最適宜的發(fā)酵菌種。

圖1 不同酵母菌對無花果酒酒酒精度和維生素C含量的影響Fig.1 Effect of yeast type on alcohol and VC contents of fig wine

2.2 發(fā)酵工藝單因素試驗結果與分析

2.2.1 釀酒酵母接種量對無花果酒酒精度的影響

如圖2可知，隨著干酵母菌接種量的提高，酒精度升高，到接種量為0.03%～0.04%時，無花果酒的酒精度達到最高(11.4%vol)；接種量大于0.04%，則酒精度又略有下降。這是由于若接種量小，果汁中的糖不能完全被酵母利用轉化，致使酒精度較低；若接種量過大，酵母菌大量生長消耗了果汁中的糖分，致使產酒精的底物濃度降低從而導致了酒精度的減小。由此確定干酵母菌的適宜接種量為0.03%。

圖2 酵母菌接種量對無花果酒酒精度的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum amount on alcohol content of fig wine

2.2.2 SO2添加量對無花果酒酒精度的影響

由圖3可知，隨著SO2添加量的增加，無花果酒的酒精度呈先升高后下降的趨勢，當SO2添加量為85 mg·kg-1時，酒精度達最大。這是由于SO2添加量低時會造成雜菌污染，消耗部分糖份從而造成酒精度的偏低，SO2添加量過高，則又會抑制酵母菌的生長從而導致發(fā)酵力下降、酒精度降低。綜合考慮，確定SO2的最適添加量為85 mg·kg-1。

圖3 SO2添加量對無花果酒酒精度的影響Fig.3 Effect of SO2 concentration on alcohol content of fig wine

2.2.3 發(fā)酵溫度對無花果酒酒精度的影響

由圖4可知，在所設溫度范圍內，隨著發(fā)酵溫度的提高，無花果酒的酒精度變化趨勢是先升高后降低，當發(fā)酵溫度為28 ℃時，酒精度最高；這是由于溫度影響到酵母菌的生長，溫度低時，酵母菌發(fā)酵速度慢，產酒精度能力低，但溫度過高，酵母菌衰老速度加快，最終導致了產酒精能力降低。由此確定28 ℃為適宜的發(fā)酵溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對無花果酒酒精度的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature on alcohol content of fig wine

2.2.4 發(fā)酵時間對無花果酒酒精度的影響

圖5可知，在所設溫度范圍內，隨著發(fā)酵溫度的提高，無花果酒的酒精度變化趨勢是先升高最后趨于平緩。當發(fā)酵時間為8 d時，酒精度達到最高值；大于8 d，酒精度則趨于平緩。這是由于發(fā)酵8 d后，無花果汁中的糖分幾乎消耗殆盡，因而導致酒精含量的穩(wěn)定。由此確定8 d為適宜的發(fā)酵溫度。

2.3 無花果酒發(fā)酵條件的響應面優(yōu)化結果與分析

2.3.1 響應面試驗設計與結果分析

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理優(yōu)化無花果酒發(fā)酵條件。其試驗設計方案與結果見表1。

由表2還可知：因素A，D，B對無花果酒精度的影響顯著(P<0.01或P<0.05)，C對酒精度的影響不顯著(P>0.05)，4個因素對響應值的影響程度大小依次為D>A>B>C；交互項AB，AC，AD以及二次項A2，B2，C2，D2對酒精度的影響顯著(P<0．01或P<0．05)。說明4個因素能不同程度的對響應值產生影響，本試驗設計的因素選擇科學合理。

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance for the regression model

續(xù)表2

注：*表示P<0.05,影響顯著；**表示P<0.01,影響極顯著；N表示P>0.05,影響不顯著。
Note:*P<0.05,striking contrast;**P<0.01,Extremely striking contrast

2.3.2 響應面分析與優(yōu)化

根據響應面曲面的陡度程度分析任意2個因素取零點水平時，其他兩個因素的交互作用對無花果酒酒精度的影響程度，曲面越陡，表明變量對酒精度的影響越大[16]。由圖6可見，在3個交互項中，任何2個交互因素的響應面都存在最高點，釀酒干酵母接種量(A)與SO2添加量(B)、釀酒干酵母接種量(A)與發(fā)酵溫度(C)、釀酒干酵母接種量(A)與發(fā)酵天數(D)的響應面曲面坡度均較陡峭，其交互作用對無花果酒精度的影響也較為顯著。

2.3.3 發(fā)酵條件最優(yōu)條件及驗證試驗

通過軟件分析優(yōu)化，得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數：釀酒干酵母接種量0.03 %、焦亞硫酸鉀添加量82.89 mg·kg-1、發(fā)酵溫度28.02 ℃、發(fā)酵天數8.44 d，此條件下無花果果酒的理論酒精度為12.21 %vol。為了操作方便，修正發(fā)酵參數為：釀酒干酵母接種量0.03 %，焦亞硫酸鉀添加量85 mg·kg-1，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵天數8 d，進行3次平行試驗，得出無花果果酒的實際酒精度為12.20% vol，與理論預測值吻合程度很高，說明該試驗結果穩(wěn)定、可靠，該模型可以較好地預測無花果酒發(fā)酵條件與酒精度的關系。

2.4 無花果酒抗氧化活性分析

在最佳發(fā)酵工藝條件下進行試驗，檢測無花果汁發(fā)酵前和發(fā)酵結束后的酒液中的主要抗氧化活性成分和自由基清除率，結果如表3所示。由表3可見，與發(fā)酵前相比，·OH清除率無顯著差異(P>0.05)，DPPH自由基清除率顯著提高(P<0.05)。說明酒精發(fā)酵可以顯著提高無花果的生物活性物質含量和自由基清除能力，無花果酒比無花果汁具有更強的抗氧化能力和生物保健功能。

圖6 各因素交互作用影響無花果酒酒精度的響應面圖Fig.6 Response surface plot showing the effects of yeast inoculum amount,SO2 concentration,fermentation temperature,and time on alcohol content of fig wine

表3 無花果酒抗氧化活性成分和自由基清除能力檢測結果Table 3 Detectionresults of antioxidant components and free radical scavenging activity in fig wine

注：a表示差異顯著(P<0.05)，A表示差異極顯著(P<0.01)。
Note:a indicates significant difference(P<0.05);A indicates that the difference is extremely significant(P<0.01).

2.5 無花果酒理化指標分析

在最佳發(fā)酵工藝條件下進行實驗，檢測無花果汁發(fā)酵前和發(fā)酵結束后無花果酒中的理化指標，結果見表4。由表4可見，無花果酒中的維生素C、總酚、黃酮含量分別比發(fā)酵前提高了4倍、1.27倍、1.64倍。這表明，相較于無花果汁，無花果酒具有更高的營養(yǎng)價值，其原因可能在于發(fā)酵過程中產生了這些物質。

表4 無花果酒理化指標Table 4 Physicochemical indices of fig wine

注：a表示差異顯著(P<0.05)，A表示差異極顯著(P<0.01)。
Note:a indicates significant difference(P<0.05);A indicates that the difference is extremely significant(P<0.01).

3 討論與結論

影響果酒風味與品質的因素很多，釀酒用果實品種、釀酒酵母的種類與發(fā)酵性能、工藝條件均能影響果酒的口感和風味[17～19]。國內果酒大多采用葡萄酒釀酒酵母發(fā)酵而成，缺乏典型性和專一性，因而很難在不同類型果酒品質提升上有所突破，本研究通過考察不同酵母菌對無花果酒酒精度和維生素C含量的影響，確定釀酒酵母RV171為適宜的發(fā)酵菌種；通過單因素試驗和響應面分析法，建立了發(fā)酵條件為自變量、酒精度為響應值的數學模型：Y=12.10+0.27A-0.12B+0.058C+0.40D-0.43AB-0.27AC+0.25AD-0.12BC+0.075BD+0.075CD-0.54A2-0.53B2-0.42C2-0.64D2。優(yōu)化得到了無花果酒的最佳發(fā)酵工藝參數為：釀酒干酵母接種量0.03 %，SO2添加量85 mg·kg-1，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵天數8 d，酒精度為12.2 %vol，與預測值吻合程度很高，表明該模型科學合理，可以對無花果酒的產業(yè)化生產起到很好的指導作用。

多酚、黃酮等化合物是葡萄酒、蘋果酒等果酒中重要的組成成分，參與或決定酒的色澤、香氣、穩(wěn)定性、收斂性等，同時也是果酒發(fā)揮抗氧化、抗衰老等保健功能的物質基礎[20～22]。本研究檢測了最佳工藝條件下生產的無花果酒中維生素C、總酚、黃酮等主要抗氧化成分，并評估了其自由基清除能力，結果表明無花果酒對DPPH自由基的清除率達75.32%，對·OH的清除能力達342.93 U·mL-1，酒中維生素C、總酚、黃酮含量分別比發(fā)酵前提高了4倍、1.27倍、1.64倍?？梢娋凭l(fā)酵過程能夠顯著提高無花果汁的抗氧化活性，無花果酒具有比無花果汁更強的營養(yǎng)保健功能，可以作為一種抗氧化劑和自由基清除劑，具有廣闊的市場開發(fā)前景。