大白菜黑腐病研究進(jìn)展

孟雪嬌 史慶馨 陳立新

摘? ? 要：近年來，大白菜黑腐病日益加重。筆者綜述了大白菜黑腐病的病害癥狀、黑腐病病原菌的特征特性、黑腐病病原菌對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響、黑腐病蛋白質(zhì)組學(xué)研究等進(jìn)展。如黑腐病菌侵染植物后活性氧的生成速率增加、抗氧化酶活性也發(fā)生改變;蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，防御和脅迫、及光合系統(tǒng)相關(guān)的蛋白豐度增加，茉莉酸和乙烯途徑被激活。

關(guān)鍵詞： 大白菜; 黑腐病; 特征特性; 抗病性鑒定

Research progress on black rot in Chinese cabbage

MENG Xuejiao1，2， SHI Qingxin2， CHEN Lixin 2

（1. Postdoctoral Programme， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， Heilongjiang， China; 2. Horticultural Sub-academy， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069， Heilongjiang， China）

Abstract： In recent years， black rot in Chinese cabbage has become increasingly serious. This paper reviews the research progress of black rot disease symptoms in Chinese cabbage， the characteristics of its pathogen， the effects of its pathogen on the antioxidant system， proteomics study of this disease， etc.. Such as infection of its pathogen lead to increase of the rate of reactive oxygen species production， and changes of the activity of antioxidant enzymes. Proteomics studies show that the abundance of defense and stress， and photosynthetic system-related proteins increased， jasmonic acid and ethylene pathways are activated.

Key words： Chinese cabbage; Black rot; Characteristics; Identification of disease resistance

全國白菜種植面積從1996年的60萬hm2擴(kuò)大到2014年的260萬hm2，占全國蔬菜總面積的13%;總產(chǎn)量11 000萬t，占全國蔬菜總產(chǎn)量的15.5%。十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種[Xanthomonas campestris pv. campestris （Pam.） Dowson]引起的世界性重要病害之一[1]。黑腐病寄主范圍相當(dāng)廣泛，主要危害甘藍(lán)、結(jié)球白菜、不結(jié)球白菜、蘿卜、油菜、花椰菜、青花菜、綠菜花等[2-12]。由于氣候條件變化、多茬栽培、國外春大白菜品種的引進(jìn)和黑腐病病原菌分化等，黑腐病對(duì)蔬菜生產(chǎn)的威脅日益加重。20世紀(jì)80年代，黑腐病在全國各地已經(jīng)普遍流行，北起黑龍江、南至海南島均有分布，使大白菜產(chǎn)量和品質(zhì)遭受很大損失[13-15]，并且感染了十字花科以外的蔬菜[16]。

1 大白菜黑腐病病害癥狀

十字花科蔬菜黑腐病主要發(fā)生在秋季，早播、多雨時(shí)節(jié)和重茬地塊發(fā)病嚴(yán)重[17]。十字花科黑腐病菌通過排水器、氣孔、根、或創(chuàng)傷口侵染十字花科植物，主要危害葉片、葉球和球莖[18-19]。大白菜幼苗期即可發(fā)病，但以成株發(fā)病為主。

大白菜幼苗期發(fā)生黑腐病時(shí)，真葉的葉脈上出現(xiàn)小黑斑或細(xì)黑條，根髓部變黑;成株期時(shí)，細(xì)菌從葉緣的水孔侵入，之后形成三角形褪綠黃斑，葉緣產(chǎn)生黃褐色壞死斑，再沿葉脈蔓延，逐漸擴(kuò)大成“V”字形或長(zhǎng)條形黃褐斑，邊周伴有黃色褪綠暈帶，該葉脈變黑壞死[20]。

2 黑腐病菌特征特性研究

野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestris pv. Campestri）（Xcc）為短桿菌，革蘭氏染色陰性，細(xì)胞大小為（0.4～0.5） μm×（0.7～3.0） μm，有莢膜，無芽孢，極生鞭毛，菌體單生或鏈生。在牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基上近圓形，初期呈淡黃色，后期變蠟黃色，形成黏稠狀菌落。黑腐病菌生長(zhǎng)最適溫度為25～30 ℃，最低5 ℃，最高39 ℃，致死溫度為51 ℃，最適濕度為80%～100%[21]，在干燥環(huán)境下仍可存活12個(gè)月[22]。

研究發(fā)現(xiàn)黑腐病病原菌的生理小種分化十分復(fù)雜。有關(guān)1、4、6號(hào)生理小種的報(bào)道是最多的。解永梅等[23]分別在細(xì)胞和分子水平上完成了山東省地區(qū)的黑腐病病原菌鑒定，進(jìn)行致病性測(cè)定后獲得4株強(qiáng)致病力的菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些病原菌的生物學(xué)特性基本一致，可以確定為同一種病原菌，并鑒定為Xanthomonas campestris pv.campestris，并確定此病原菌就是引起山東省大白菜黑腐病的致病菌。蘆燕等[24]對(duì)采自陜西省不同地區(qū)的35個(gè)大白菜黑腐病病原菌菌株的致病類型進(jìn)行了劃分，用7個(gè)不同抗性大白菜品種作為鑒別寄主，根據(jù)植物的抗病性反應(yīng)將這35個(gè)大白菜黑腐病菌株劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 6類致病型，其中，Ⅲ型致病力最強(qiáng)，Ⅱ型為典型致病型。

其他研究，如侵染擬南芥的3個(gè)菌株CN14，CN15和CN16的基因組序列被檢測(cè)，獲得了不可預(yù)期的結(jié)果，在日后分析比較方面具有重要作用[25]。

3 抗病性鑒定

近年來，我國對(duì)大白菜黑腐病的研究報(bào)道不多。在抗病育種過程中，進(jìn)行抗病性鑒定來篩選抗病品種是必不可少的。因溫度、濕度等試驗(yàn)條件相對(duì)較易控制，且節(jié)約空間，所以，抗病性鑒定工作主要在室內(nèi)進(jìn)行。

翟文慧等[26]進(jìn)行了大白菜黑腐病鑒定的濕度試驗(yàn)，及其苗期與成株期抗病性的相關(guān)分析研究，研究發(fā)現(xiàn)大白菜苗期與成株期抗病性呈顯著線性關(guān)系，說明用苗期人工接種鑒定大白菜黑腐病抗性的方法可行且可靠，可以縮短研究時(shí)間。

蘆燕和張魯剛[27]以陜西省大白菜主產(chǎn)區(qū)致病力強(qiáng)的黑腐病菌株YL-17做菌源，以4個(gè)不同抗病性的大白菜品種為試材，研究了苗齡、接種濃度和發(fā)病溫度對(duì)抗病性鑒定的影響，建立了優(yōu)化的大白菜黑腐病苗期人工接種鑒定方法，該方法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。即接種方法采用噴霧法，接種菌量為1.0×108 pfu·mL-1，接種時(shí)期為4～5葉期，發(fā)病溫度控制在26 ℃。解永梅[20，23]對(duì)山東省大白菜黑腐病的研究，完善了黑腐病抗病性鑒定方法研究，證明了黑腐病菌存在致病型分化，并進(jìn)行了抗性資源的篩選等。

4 黑腐病菌對(duì)抗氧化系統(tǒng)和植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

植物感染病原菌后，體內(nèi)活性氧生成速率、防御酶的活性發(fā)生改變，并發(fā)現(xiàn)這些變化與植物的抗病性相關(guān)。

解永梅等[20]對(duì)不同抗性白菜品種接種黑腐病菌，接種后發(fā)現(xiàn)，抗病品種多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性高于感病品種，且PPO活性的變化與品種抗病性表現(xiàn)呈正相關(guān)。多酚氧化酶（PPO）可催化酚類物質(zhì)氧化成醌，具有很強(qiáng)的毒性，能殺死病原菌，推測(cè)抗病品種抗黑腐病可能與PPO活性升高有關(guān)。苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）是植物次生物質(zhì)代謝系統(tǒng)中關(guān)鍵的一個(gè)酶，解永梅等[20]的研究還發(fā)現(xiàn)PAL與PPO的表現(xiàn)相同，即抗性強(qiáng)的品種中 PAL的活性要高于抗性弱的品種，激活次生代謝。

蔚麗珍等[28-29]對(duì)黑腐病菌侵染不同抗性大白菜幼苗后葉片抗氧化系統(tǒng)的反應(yīng)也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在接種黑腐病菌36 h后超氧陰離子產(chǎn)生速率直線上升，且抗性品種的增加更為明顯，丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）作為膜脂過氧化的標(biāo)志，其含量均上升，但總體上來說抗病品種的MDA含量明顯低于感病品種，表明 MDA含量與抗病性呈負(fù)相關(guān)。總體上，抗病品種和感病品種接種黑腐病菌后超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性均高于對(duì)照，這與解永梅[20]之前的研究結(jié)果一致，阻止了體內(nèi)活性氧的過量積累，SOD活性與抗病性呈正相關(guān)。過氧化物酶（peroxidase，POD）活性升高，與解永梅[20]的研究結(jié)果一致，且發(fā)現(xiàn)與不同的發(fā)病階段相一致，與抗病性呈負(fù)相關(guān)。過氧化氫酶（catalase，CAT）活性則二者變化不一致，抗性材料表現(xiàn)為升-降-升，感性材料表現(xiàn)為先降后升。而解永梅[20]的研究發(fā)現(xiàn)接種黑腐病菌后，不同抗性品種的CAT活性均急劇下降，之后感病品種呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，而抗病強(qiáng)的品種在下降之后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)達(dá)到最高峰后又逐漸下降。

其他十字花科蔬菜也有相關(guān)研究，如通過比較不同抗病類型的青花菜接種黑腐病菌后防御酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)抗病材料具有較高的POD、PPO、PAL活性，而感病材料的SOD活性較高[30]。接種后抗病材料的SOD、POD、PAL、PPO和CAT活性均高于對(duì)照，且活性變化率高于感病材料[30]，與他人相關(guān)研究結(jié)果一致，“抗病”品種比“感病”品種保持了較高的酶活性[31];甘藍(lán)黑腐病的研究發(fā)現(xiàn)，接種病原菌后，6個(gè)品種葉片中SOD、POD、PAL和PPO等4種酶活性均升高，且品種間差別較大[32]。

不同抗性材料接種黑腐病菌后發(fā)現(xiàn)，抗病材料細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器受損傷程度較輕且較晚，并伴隨細(xì)胞壁加厚和膜結(jié)構(gòu)小泡數(shù)量增多的現(xiàn)象，且細(xì)胞壁周圍有致密聚集物出現(xiàn);而感病材料受損嚴(yán)重且較早，細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)胞器膨脹變形，功能喪失，最后整個(gè)細(xì)胞解體死亡[30，33]。

5 轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)研究

黑腐病菌轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn)，prc基因，即XCC致病機(jī)制相關(guān)的特殊蛋白酶發(fā)生轉(zhuǎn)位子突變，引起毒性及胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)量降低，RNA-Seq發(fā)現(xiàn)91個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因主要參與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜生成、翻譯后修飾、蛋白周轉(zhuǎn)和分子伴侶、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[34]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，為深入分析植物應(yīng)答生物及非生物脅迫的代謝和調(diào)控機(jī)制提供了高通量的技術(shù)平臺(tái)，利用此平臺(tái)中的雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術(shù)、凝膠染色技術(shù)、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）、以及生物質(zhì)譜技術(shù)等能夠系統(tǒng)地分析植物體細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織和器官應(yīng)答脅迫的蛋白質(zhì)組變化。

關(guān)于野油菜黃單胞菌野油菜致病變種與寄主甘藍(lán)（Brassica oleracea）表達(dá)的最新蛋白質(zhì)組學(xué)研究，即Santos等[35]運(yùn)用label-free shotgun 2D-nanoUPLC/MSE分析XCC與易感植物（Kenzan-REK）、抗性植物（Uni?ao-REU）共生及培養(yǎng)基（對(duì)照）中情況，并運(yùn)用qPCR方法確定被選擇的一些基因的差異表達(dá)情況，該篇文章主要研究病菌的致病性機(jī)制。一些野油菜黃單胞菌株的完整基因組序列已知，可以編碼4 000多個(gè)蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)在病原菌侵染48 h后Xcc 細(xì)胞數(shù)量最多，之前該研究團(tuán)隊(duì)也運(yùn)用雙向電泳技術(shù)研究XCC與甘藍(lán)互作，但是只鑒定了少量蛋白。大部分報(bào)道都是研究細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，很少研究黃胞桿菌屬蛋白積累在植物提取物中。通過比較抗性植物（REU）及對(duì)照，發(fā)現(xiàn)121個(gè)差異蛋白質(zhì)，鑒定到108個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中80個(gè)是對(duì)照特有的，在抗性植物中14個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，14個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)。易感植物與對(duì)照的比較中，發(fā)現(xiàn)127個(gè)差異蛋白質(zhì)，鑒定到105個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中46個(gè)是對(duì)照特有的，在易感植物中34個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，22個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)，大部分差異蛋白表達(dá)豐度是增加的，主要參與細(xì)胞代謝（如檸檬酸循環(huán)、糖酵解、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、及其他碳水化合物代謝），15%參與蛋白質(zhì)合成（如轉(zhuǎn)錄和翻譯因子，及核糖體蛋白）?？剐灾参锱c易感植物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異表達(dá)蛋白，易感植物中有4個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，13個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)，且有5個(gè)蛋白是易感植物特有的。在植物中，鑒定到參與乙烯感應(yīng)和誘導(dǎo)茉莉酸的蛋白質(zhì)，說明甘藍(lán)與病原體互作過程中茉莉酸和乙烯途徑被激活。特別的是，一些防御和脅迫相關(guān)蛋白在抗性植物中被鑒定到，如脂氧合酶、膜聯(lián)蛋白等，還有光合系統(tǒng)相關(guān)的蛋白，這些都說明植物通過增加調(diào)節(jié)光合作用的重要蛋白質(zhì)來減少黑腐病菌帶來的損傷[35]。

6 展 望

大白菜因其纖維素含量豐富，受廣大消費(fèi)者的喜愛，種植面積較大，尤其是東北地區(qū)，因受傳統(tǒng)習(xí)俗影響，人們還有貯藏秋菜和腌制酸菜的習(xí)慣。另一方面，近年來，隨著白菜加工業(yè)不斷壯大，對(duì)白菜的需求量一直較大。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黑龍江省大白菜的黑腐病日益加重，為了保證市民的菜籃子工程，急需加大力度對(duì)其進(jìn)行研究，通過分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)加強(qiáng)黑腐病菌致病機(jī)制的研究，急需培育滿足產(chǎn)業(yè)及市場(chǎng)需求的新一代優(yōu)質(zhì)多抗新品種。這不僅是科研工作者的任務(wù)，也是社會(huì)的需求。

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