HPLC測(cè)定四川梓潼產(chǎn)葛根和粉葛中四種異黃酮含量的分析

徐煒?shù)h 杜春燕 徐書(shū)宇 李琪源 蘇麗麗 楊剛 蔣合眾

摘要：采用YMC-Pack ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）測(cè)定四川梓潼產(chǎn)葛根和粉葛中4種異黃酮（葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元）含量。結(jié)果測(cè)得葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的線性范圍分別為0.050～0.750、0.010～0.150、0.010～0.150和0.012～0.180 μg，線性關(guān)系良好（r>0.999），平均加樣回收率為96.52%～100.22%，RSD為0.75%～1.84%。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于葛根中異黃酮含量的測(cè)定。梓潼產(chǎn)葛根中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量明顯高于粉葛，且梓潼產(chǎn)葛根和粉葛中大豆苷元含量明顯高于其他產(chǎn)地的葛根和粉葛。

關(guān)鍵詞：葛根;粉葛;高效液相;異黃酮;含量

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.7+2? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）09-0114-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.027? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： To determine the contents of four isoflavones of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii in Sichuan Zitong by HPLC. The chromatographic conditions were YMC-Pack ODS-A C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）. The linear range of puerarin， 3′-methoxy puerarin， daidzin and daidzein were 0.050～0.750， 0.010～0.150， 0.010～0.150 and 0.012～0.180 μg， respectively， and it showed a good linear relationship（r>0.999）， the average recovery rate was between 96.52%～100.22%， and RSD was between 0.75%～1.84%（n=6）. This method is simple， accurate and reproducible. It is suitable for the determination of isoflavones in Puerarin. The contents of 4 isoflavones of P. lobata are obviously higher than P. thomsonii from Zitong， Sichuan Province. And the content of daidzein in P. lobata and P. thomsonii from Zitong is obviously higher than other habitat origins reported.

Key words： Pueraria lobata; Pueraria thomsonii; HPLC; isoflavone; content

葛根和粉葛分別來(lái)源于豆科葛屬植物野葛[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]和甘葛藤[Pueraria thomsonii Benth]的干燥根[1]，味甘、辛、涼，歸脾、胃經(jīng)，具有解表退熱、生津、透疹、升陽(yáng)止瀉之功效[1-3]，均含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類(lèi)活性成分，但由于基源不同，兩者所含活性物質(zhì)的量存在一定差別[4-6]，《中華人民共和國(guó)藥典》從2005年版開(kāi)始也將葛根和粉葛作為兩個(gè)品種分開(kāi)[7-9]。

葛根和粉葛在四川分布廣泛，梓潼縣為“5.12”地震受災(zāi)區(qū)，災(zāi)后重建過(guò)程中當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)在政府幫扶和支持下大量種植葛根和粉葛，但其主要藥效成分的含量未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用HPLC法，以葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元為指標(biāo)，對(duì)梓潼產(chǎn)葛根和粉葛藥材進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，為當(dāng)?shù)貎煞N藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)和資源利用提供參考。

1? 材料與方法

1.1? ?材料

試驗(yàn)所用葛根和粉葛藥材于2016年12月采自四川梓潼縣富庫(kù)葛根專(zhuān)業(yè)合作社種植基地，經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科副教授鑒定為豆科植物野葛和甘葛藤的干燥根。

1.2? 儀器與試藥

Agilent 1260 Infinity Series高效液相色譜儀;XY-200型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市松青五金廠）;BSA124S電子天平，十萬(wàn)分之一（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）;SK7200LH超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;UPR-11-10T超純水器。

葛根素（批號(hào)為110752-200912）、大豆苷（批號(hào)為111738-200501）、大豆苷元（批號(hào)為111502-200402）對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;3′-甲氧基葛根素（批號(hào)為MUST-13092410）對(duì)照品購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇為色譜純，水為超純水（自制）。

1.3? 方法

1.3.1? 供試品溶液的制備? 精密稱(chēng)取梓潼葛根和粉葛粉末（過(guò)3號(hào)篩）0.1 g，置于圓底燒瓶中，精密加入50 mL 30%乙醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用30%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，0.45 μm微孔膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2? 混合對(duì)照品溶液的制備? 分別精密稱(chēng)取葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻。精密移取0.5 mL，置于5 mL量瓶中，甲醇定容，使其質(zhì)量濃度分別為50.00、10.00、10.00、12.00 μg/mL，保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.3.3? 色譜條件? YMC-Pack ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，25% B;10～35 min，25%～44% B;35～40 min，44%～49% B;40～45 min，49%～60% B;45～55 min，60%～25% B）;流速1.0 mL/min;柱溫22 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2? 結(jié)果與分析

2.1? HPLC色譜

HPLC色譜見(jiàn)圖1。

2.2? 線性關(guān)系考察

吸取“1.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、6、10、 15 μL，在“1.3.3”色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸[10]，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3? 精密度試驗(yàn)

精密吸取“1.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面積RSD分別為1.77%、2.06%、1.44%、1.50%，表明儀器精密度良好。

2.4? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品適量，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“1.3.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得葛根的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面積RSD分別為1.28%、1.64%、1.68%、0.55%;粉葛的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面積RSD分別為2.09%、1.77%、1.06%、0.62%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5? 重復(fù)性試驗(yàn)

取葛根和粉葛藥材各3份，精密稱(chēng)定，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.3.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得葛根的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元含有量RSD分別為0.85%、0.56%、1.93%、0.40%;粉葛的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元含有量RSD分別為1.31%、1.35%、1.37%、0.70%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6? 加樣回收試驗(yàn)

精密稱(chēng)取葛根和粉葛藥材各3份，每份0.06 g，精密加入葛根素（1.98 mg/mL）對(duì)照品溶液2 mL、3′-甲氧基葛根素（0.10 mg/mL）對(duì)照品溶液1 mL、大豆苷（0.20 mg/mL）對(duì)照品溶液1 mL、大豆苷元（0.13 mg/mL）對(duì)照品溶液1 mL，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7? 樣品含量測(cè)定

稱(chēng)取梓潼產(chǎn)葛根和粉葛各3份，按“1.3.1”的方法制備供試品溶液，在“1.3.3”色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，梓潼產(chǎn)葛根中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量明顯高于粉葛中的含量，說(shuō)明梓潼產(chǎn)葛根的品質(zhì)優(yōu)于粉葛。

3? 討論

葛根和粉葛在中國(guó)南方地區(qū)分布廣泛，其中葛根是著名的藥食同源藥材。試驗(yàn)采用甲醇-水溶液梯度洗脫法，能使葛根和粉葛中的幾類(lèi)主要異黃酮化合物得到較好的分離。四川梓潼產(chǎn)葛根中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量明顯高于粉葛中的含量，說(shuō)明梓潼產(chǎn)葛根的品質(zhì)優(yōu)于粉葛;梓潼產(chǎn)葛根和粉葛中大豆苷元的含量明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道的其他產(chǎn)地的葛根和粉葛[10-12]，可為四川梓潼產(chǎn)葛根和粉葛的品質(zhì)評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

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收稿日期：2018-10-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家重大科技專(zhuān)項(xiàng)（2013ZX09103002-014）;2017年中醫(yī)藥公共衛(wèi)生服務(wù)補(bǔ)助專(zhuān)項(xiàng)[財(cái)社（2017）66號(hào)];四川省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專(zhuān)項(xiàng)（2016Q037）;大學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2017093;201710613067）;第12期大學(xué)生個(gè)性化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（GX201812098）

作者簡(jiǎn)介：徐煒?shù)h（1996-），男，浙江紹興人，在讀本科生，制藥工程專(zhuān)業(yè)，（電話）17713550530（電子信箱）524417896@qq.com;通信作者，蔣合眾（1980-），男，重慶銅梁人，副教授，博士，主要從事天然藥物化學(xué)研究，（電子信箱）jianghz10@sina.com。