文蛤生物活性多肽／蛋白研究進(jìn)展

陳 琛，藺蓓蓓，徐尤美，李鑫鑫，劉 祥

（陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所，陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000）

文蛤（Meretrix meretrix）屬軟體動(dòng)物門，雙殼綱，真瓣鰓目，簾蛤科，文蛤?qū)伲?］。在西太平洋（中國(guó)、朝鮮半島、日本和東南亞）和印度洋（亞丁灣和阿曼灣）等海域廣泛分布，常在河口及有淡水注入的內(nèi)灣附近棲息。

文蛤肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有18種氨基酸，其中含有人體所需的全部10種必需氨基酸，文蛤肉中總氨基酸含量為428～506 mg·g-1，必需氨基酸含量為168～188 mg·g-1，其中亮氨酸和賴氨酸含量較高，分別是31～37 mg·g-1和 35～36 mg·g-1，必需氨基酸（EAA）／總氨基酸（TAA）和EAA／非必需氨基酸（NEAA）的值分別為39%和64%，基本符合FAO／WHO優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［2］。文蛤肉含有礦物質(zhì)、維生素以及不飽和脂肪酸DHA和EPA［3］，DHA和EPA含量分別占總脂肪酸的 13．33% ～16．47%和4．75%～7．11%。文蛤不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且還有食療和藥用價(jià)值。文蛤作為中藥資源被列入《本草綱目》、《傷寒雜病論》等中醫(yī)典籍中［4］，具有平肝化痰、清肺、軟堅(jiān)散結(jié)、制酸止痛等功效，用于肺結(jié)核、陰虛盜汗、糖尿病以及腫瘤等疾病治療，而且還有降糖、降血脂、抗突變、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種功效［5］。文蛤殼可用于治療前列腺增生、濕疹、潰瘍、鵝口瘡、中耳炎、肺結(jié)核等疾病。

20世紀(jì)60年代有國(guó)外學(xué)者研究證實(shí)了文蛤提取物的抗腫瘤活性，并將研究結(jié)果發(fā)表在《Science》雜志［6］；90年代末國(guó)內(nèi)學(xué)者開展了文蛤抗腫瘤活性物質(zhì)的研究。進(jìn)入21世紀(jì)以后，從海洋生物中尋找新的活性物質(zhì)受到了很大的重視，加之現(xiàn)代生物技術(shù)興起與分離純化技術(shù)的成熟應(yīng)用等，使得文蛤活性成分的研究持續(xù)開展，通過大量的研究與藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了文蛤活性物質(zhì)的藥理作用、生物功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前已經(jīng)分離純化、鑒定了以下文蛤活性成分：1）文蛤活性肽（抗腫瘤肽、抗氧化肽、抗菌肽、降壓肽、寡肽）；2）文蛤活性蛋白（凝集素、鐵蛋白、金屬硫蛋白、熱休克蛋白、腺苷二磷酸核糖基化蛋白、抗補(bǔ)體蛋白、腫瘤壞死因子、凝血蛋白、葡聚糖結(jié)合蛋白）；3）文蛤酶及酶制劑（溶菌酶、乳酸脫氫酶、組織蛋白酶、谷胱甘肽過氧化物酶、N-羥甲基-L-丙氨酸脫氫酶、抗氧化酶、腺苷脫氨酶、堿性磷酸酶、磷酸水解酶）；4）酸類（丁醛、乙酸、肉豆蔻酸、十六烯酸、棕櫚酸）；5）多糖；6）甾醇；7）油脂；8）其它成分，如類胡蘿卜素。本文重點(diǎn)闡述文蛤生物活性肽和蛋白的研究進(jìn)展，以期為文蛤活性物質(zhì)的研究開發(fā)提供參考。

1 文蛤活性蛋白／多肽研究

目前已從文蛤肉中鑒定了20多種具有各種生物活性或功能的多肽或蛋白，詳見表2。

1．1 抗腫瘤肽／蛋白

文蛤抗腫瘤肽／蛋白是研究最早、取得成果最多的文蛤活性成分之一，目前已經(jīng)從文蛤中鑒定了多種抗腫瘤肽／蛋白，詳見表3。SCHMEER［21］的研究揭示文蛤中含有腫瘤抑制因子，經(jīng)提取得到的腫瘤抑制因子對(duì)小鼠S180肉瘤有顯著的抑制作用，對(duì)正常小鼠則無(wú)毒性，并將這一活性物質(zhì)命名為“蛤素”（mercenene）。對(duì)蛤素成分的研究表明，它是一類相對(duì)分子質(zhì)量小于10 kDa的多肽類物質(zhì)。

在我國(guó)，文蛤抗腫瘤活性多肽方面的研究也取得了很多成果。利用凝膠色譜和高效液相色譜法純化得到文蛤抗腫瘤肽，基質(zhì)輔助的激光解析質(zhì)譜測(cè)得其分子為3．147 kDa，該肽能夠抑制人胃腺癌細(xì)胞的增殖并破壞人胃腺癌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)骨架，當(dāng)多肽的濃度達(dá)到4．0μg·mL-1時(shí)，對(duì)癌細(xì)胞的抑制率為 60%［22］。NING等［23］從文蛤體腔液體中利用硫酸銨沉淀、離子交換色譜和疏水色譜分離純化得到文蛤抗腫瘤肽MML，分子量約為40 kDa，對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116等均有抑制作用。WANG等［24］從文蛤中純化得到15 kDa的多肽Mere15，對(duì)人白血病細(xì)胞K562和人肺癌細(xì)胞A549有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）均為38．2μg·mL-1，機(jī)理是通過線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡。為了解決由惡性腫瘤細(xì)胞所造成的難以治愈的癌癥，迫切需要尋找抗腫瘤天然活性物質(zhì)，文蛤中的抗腫瘤肽／蛋白可為此提供寶貴資源。采用分離純化技術(shù)鑒定得到了10多種文蛤抗腫瘤蛋白，進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)定，表明其具有很好的抗腫瘤活性，但目前文蛤抗腫瘤藥物的開發(fā)和市場(chǎng)化相對(duì)滯后。

表1 文蛤肉營(yíng)養(yǎng)成分及含量Tab．1 General nutritive composition in muscles of M．meretrix （%）

表2 文蛤生物活性肽（蛋白）及特性Tab．2 Bioactive peptides（proteins）and their characteristics in M．meretrix

表3 文蛤抗腫瘤肽（蛋白）及特性Tab．3 Antitumor peptides（proteins）and their characteristics in M．meretrix

1．2 抗菌肽

抗生素殘留及耐藥性迫使人類不斷尋找開發(fā)新型、天然、耐藥性低的抗生素替代品，抗菌肽是一類具有抗菌活性的小分子活性肽，SUGESH等［30］將文蛤肉進(jìn)行勻漿后，用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，提取物對(duì)10株病原性細(xì)菌和6株病原性真菌具有較好的抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌抑菌活性最好。SATHYAN等［8］從文蛤中通過分子克隆得到Histone-H2A來(lái)源的抗菌肽Molluskin，由25個(gè)氨基酸組成，分子量為 2．840 kDa，與皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）抗菌肽Abhisin同源性較高。抗菌肽較傳統(tǒng)抗生素有很多優(yōu)點(diǎn)，包括分子量小、熱穩(wěn)定、水溶性好、強(qiáng)堿性、廣譜抗菌和作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)，在醫(yī)藥衛(wèi)生、畜牧業(yè)、食品防腐劑等方面有廣闊的應(yīng)用前景。

1．3 降血壓肽

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）在血壓調(diào)控中起到了非常關(guān)鍵的作用，通過催化血管緊張素轉(zhuǎn)移酶I的C端使其裂解為具有活性的血管緊張素轉(zhuǎn)移酶II，后者誘導(dǎo)醛固酮的釋放引起鈉離子內(nèi)流，使血壓升高。從文蛤肉水解物和酶解物中可分離提取ACE抑制劑。提取方法是：超濾、凝膠過濾色譜Sephadex G-25、RP-HPLC等純化程序得到2個(gè)純品肽E1和E2，其中E2僅為2個(gè)氨基酸（Tyr-Asn）組成，IC50為 0．015 mg·mL-1。通過體外模擬試驗(yàn)證實(shí)可以抗消化酶降解，具有較好的生物利用度［20］。目前，高血壓患者主要以口服化學(xué)合成類的降壓藥物為主，但是服藥后會(huì)出現(xiàn)不同程度、不同癥狀的副作用，如低血壓、心動(dòng)過緩、嘔吐等。而文蛤來(lái)源的生物活性肽的降血壓效果雖然沒有合成的藥物好，但卻具有綠色、天然、安全、健康、低成本等優(yōu)點(diǎn)；其次，文蛤來(lái)源的生物活性肽既可以起到降血壓的作用，同時(shí)本身也具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，能為人們提供多種人體必需氨基酸［31］，所以有很好的開發(fā)前景。目前，文蛤降血壓肽只得到了一種，文蛤中是否還存在其它的活性更高的降血壓肽有待于進(jìn)一步研究。

1．4 抗氧化肽

文蛤體內(nèi)存在抗氧化作用的活性肽，其分子量小、機(jī)體易吸收、活性強(qiáng)，而且能有效地清除機(jī)體體內(nèi)過多的活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，防止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，在醫(yī)藥、化妝品、保健品等領(lǐng)域可以廣泛應(yīng)用［32］。有研究采用勻漿、硫酸銨分級(jí)沉淀、凝膠過濾色譜Sephadex G-150柱層析從文蛤肉中分離得到3個(gè)蛋白峰，均有一定的抗氧化活性。用胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解文蛤3種不同部位的肉（軟體部、足、內(nèi)臟團(tuán)），比較水解產(chǎn)物的抗氧化活性，然后采用FPLC、離子交換色譜和凝膠過濾色譜分離純化了文蛤抗氧化肽，抗氧化肽對(duì)DPPH的清除率為 19．1% ～82．5%［33］。多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)均開展了文蛤抗氧化肽研究，表4列出了采用單一酶、復(fù)合—雙酶水解、復(fù)合—三種酶水解的制備文蛤抗氧化肽的方法和條件。

1．5 凝集素

凝集素是一類廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中的非免疫來(lái)源的糖結(jié)合蛋白。文蛤凝集素（Meretrix meretrix lectin，MML）是一種唾液酸專一性結(jié)合的凝集素，是Ca2+依賴型凝集素。MML對(duì)40℃以上的溫度敏感，其活性在pH 5．0～8．5比較穩(wěn)定，等電點(diǎn)（pI）為5．6。MML分子是由2條肽鏈組成，這兩條肽鏈分子量分別為29 kDa和30 kDa，肽鏈間經(jīng)二硫鍵形成約為59 kDa的大亞基，再由約18個(gè)這種大亞基聚合成1 060 kDa的大分子。氨基酸組成及共價(jià)結(jié)合糖含量測(cè)定表明，MML分子是一種含5%的糖類的糖蛋白。李猛等［36］從文蛤中克隆了 C-型凝集素的基因（Mm-CTL）cDNA序列，全長(zhǎng)為1 855 bp，其開放閱讀框?yàn)?19 bp，編碼172個(gè)氨基酸。張晶晶等［10］克隆了文蛤C型凝集素1基因（Mm-Lec1）的全長(zhǎng)cDNA序列。凝集素結(jié)構(gòu)的多樣性決定了凝集素具有多種功能，為海洋貝類先天免疫的“特異性”研究提供了基礎(chǔ)。

1．6 鐵硫蛋白和金屬硫蛋白

鐵硫蛋白在動(dòng)植物組織中廣泛存在，由24條多肽鏈（亞基）形成一中空的球形殼，其中央孔穴可容納4 500個(gè)鐵原子，鐵為可溶、可使用形式，主要與羥基和磷酸基團(tuán)結(jié)合，在機(jī)體代謝中起著非常重要的作用。文蛤鐵蛋白亞基（MmeFer）在文蛤貝殼形成中可能起到了關(guān)鍵作用［37］。

金屬蛋白質(zhì)為低分子量、高巰基含量，能大量結(jié)合重金屬離子，因此稱為金屬硫蛋白（MT），它能被金屬離子、氧化損傷以及外界免疫刺激等多種因素誘導(dǎo)，參與生物體內(nèi)金屬水平的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、自由基清除、重金屬解毒等生物學(xué)功能，已被聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署遴選為海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物之一。蔣國(guó)萍等［11］采用RACE技術(shù)從斧文蛤（Meretrix lamarckii）中獲得了金屬硫蛋白（Mm-MT）的全長(zhǎng) cDNA序列，序列全長(zhǎng)636 bp，開放閱讀框長(zhǎng)度為231 bp，編碼76個(gè)氨基酸，編碼的氨基酸中半胱氨酸含量豐富，占27%，預(yù)測(cè)分子量約為7．704 kDa，pI 7．138，序列特征分析表明，含有16個(gè)MT所特有的Cys-Xn-Cys結(jié)構(gòu)，具有金屬硫蛋白的典型特征。根據(jù)金屬硫蛋白的特性，其可代替化學(xué)品用于化妝品、保健品和金屬檢測(cè)等行業(yè)［38］。

表4 文蛤抗氧化肽及特性Tab．4 Antioxidant peptides and their characteristics in Meretrix meretrix

1．7 凝血蛋白

CHENG等［13］研究發(fā)現(xiàn)了文蛤凝血蛋白（hemagglutinating proteins，HAP），收集文蛤血漿，透析，通過蛋白純化色譜儀（Sephacryl S-300柱）純化得到HAP，分子量為358 kDa，其由2個(gè)亞基組成。HAP對(duì)人、犬、莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）血液具有較好的凝集活性，在 pH 7．0、溫度 4～10℃、鹽度低于0．5%時(shí)，對(duì)莫桑比克羅非魚血液凝集滴度達(dá)到210。文蛤凝血蛋白的鑒定和活性研究為未來(lái)開發(fā)制備天然凝血生物制品提供了選擇。

1．8 抗血管生成蛋白

血管生成抑制蛋白可以多種因子為靶標(biāo)抑制血管的形成。在惡性腫瘤靶向治療中可以抑制腫瘤細(xì)胞血管的生成，也可應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化疾病的治療。GUPTA等［39］研究了文蛤甲醇提取物對(duì)血管生成的抑制作用，提取物濃度200μg·mL-1時(shí)，能顯著抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)的新血管的增殖，抑制率為64．63%。

1．9 免疫調(diào)節(jié)蛋白

CHEN等［40］從文蛤中克隆了編碼富含半胱氨酸的文蛤多肽（McCRIP）的cDNA序列，為一個(gè)Zn2+結(jié)合蛋白，包含高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)。McCRIP的全長(zhǎng)cDNA由237 bp的開放閱讀框組成，編碼78個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為8 635．8 Da，pI為 9．01。采用雙鏈 RNA干擾方法研究McCRIP的功能，結(jié)果表明McCRIP基因失活后可以阻斷文蛤發(fā)育，并造成大量死亡，推測(cè)McCRIP在文蛤早期發(fā)育和先天免疫中起到一定作用。就目前的研究而言，文蛤中免疫調(diào)節(jié)蛋白的免疫調(diào)節(jié)活性作用機(jī)理非常復(fù)雜，還需要進(jìn)一步深入研究。

1．10 熱休克蛋白

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是在從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物中廣泛存在的一類熱應(yīng)激蛋白質(zhì)。當(dāng)有機(jī)體暴露于高溫的時(shí)候，就會(huì)由熱激發(fā)合成此種蛋白，來(lái)保護(hù)有機(jī)體自身。文蛤熱休克蛋白（MmeHsc71）分子量為 71．43 kDa，cDNA全長(zhǎng)2 292 bp，其中包括編碼652個(gè)氨基酸的長(zhǎng)為1 959 bp的開放閱讀框。生物信息學(xué)分析確定其屬于HSP 70家族的一個(gè)成員。實(shí)時(shí)定量PCR在空間和時(shí)間上比較健康文蛤和經(jīng)溶血弧菌誘導(dǎo)的文蛤的表達(dá)模式：在空間上，在試驗(yàn)組織包括足、肝胰臟、外殼膜、鰓中都存在MmeHsc71 mRNA，但在經(jīng)溶血弧菌感染24 h誘導(dǎo)的文蛤肝胰臟和鰓中MmeHsc71 mRNA明顯增多；在時(shí)間上，分別經(jīng)溶血弧菌感染誘導(dǎo)6、12、24 h的文蛤肝胰臟與健康文蛤肝胰臟的MmeHsc71 mRNA水平表達(dá)量相比明顯增高，且與誘導(dǎo)時(shí)間呈正相關(guān)。定量免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明經(jīng)副溶血弧菌感染24 h后的文蛤肝胰臟較正常文蛤肝胰臟MmeHsc71 mRNA表達(dá)量明顯增加。推斷MmeHsc71在介導(dǎo)文蛤抗菌免疫系統(tǒng)中具有重要作用。HSP 70作為“分子伴侶”在蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解及調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而且它在細(xì)胞周期調(diào)控、抗凋亡、抗氧化、免疫治療等方面也具有重要功能，在生物工程和醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用前景十分廣闊。

1．11 腺苷二磷酸核糖基化蛋白

NAKANO等［16］從文蛤中發(fā)現(xiàn)了腺苷二磷酸核糖基化蛋白（ADP-ribosylating protein），命名為CARP-1，通過硫酸銨沉淀、離子交換CM52、超濾、凝膠過濾色譜和FPLC等步驟純化了CARP-1，利用質(zhì)譜鑒定分子量為20．332 kDa，并克隆了其cDNA。

除以上文蛤活性多肽（蛋白）以外，近年來(lái)還有學(xué)者克隆了文蛤宿主免疫防御素基因、文蛤抗補(bǔ)體蛋白、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白基因（GRB2）［41］、B型清道夫受體蛋白基因 （Mm-SRBI）［42］、文蛤 Smad家族蛋白基因（Mm-Smad1／5）［43］等。

2 文蛤蛋白酶及抑制劑

2．1 溶菌酶和抑制劑

溶菌酶是一種能破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵的堿性水解酶。文蛤1型溶菌酶基因（MmeLys）cDNA全長(zhǎng)為552 bp，其中包含一個(gè)441 bp的開放閱讀框，編碼146個(gè)氨基酸的多肽，該多肽由15個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和131個(gè)氨基酸的成熟肽組成，分子量為 14 601．44 Da［44］?？寺⊥茖?dǎo)的溶菌酶氨基酸與菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）溶菌酶具有64%的同源性，且重組表達(dá)的MmeLys對(duì)G-和G+菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。通過 RT-PCR和 western blotting證明MmeLys mRNA主要在肝胰臟和鰓內(nèi)表達(dá)。KUWANO等［45］通過乙酸提取、硫酸銨沉淀、陽(yáng)離子交換色譜、RP-HPLC分離純化得到了文蛤溶菌酶并結(jié)晶，對(duì)文蛤溶菌酶的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，并對(duì)文蛤溶菌酶三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析（圖1-A），并和蛋清溶菌酶、菲律賓蛤仔溶菌酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Glu18比較保守，在3種溶菌酶中均存在，可為水解反應(yīng)提供質(zhì)子。文蛤溶菌酶結(jié)構(gòu)解析兩年后，LEYSEN等［46］報(bào)道文蛤溶菌酶抑制劑并解析其三維結(jié)構(gòu)（圖1-B），該抑制劑能與文蛤Ⅰ型溶菌酶結(jié)合形成復(fù)合物，抑制劑由3個(gè)暴露的PLII環(huán)形成的明顯的“脊”插入到溶菌酶的底物結(jié)合槽中，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的“鎖鑰”模型，這為其它有應(yīng)用或治療前景的酶抑制劑的作用機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

2．2 超氧化物歧化酶

文蛤 Cu／Zn超氧化物歧化酶（Cu／Zn SOD）基因全長(zhǎng)cDNA 1 383 bp，具有462 bp的開放閱讀框架，編碼153個(gè)氨基酸，其在文蛤肝胰腺中表達(dá)量最高，血液細(xì)胞表達(dá)量最低［48］。采用原核表達(dá)方式在E．coli中表達(dá)了文蛤Cu／Zn超氧化物歧化酶，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化得到21 kDa蛋白，酶比活力為27．12 U·mg-1。研究表明文蛤Cu／Zn SOD能有效消除活性氧（ROS），維持免疫系統(tǒng)的氧化還原平衡，有利于文蛤免疫系統(tǒng)抵御病原微生物的感染［49］。

2．3 組織蛋白酶

機(jī)體內(nèi)的組織蛋白酶B（cathepsin B）參與溶酶體的蛋白質(zhì)水解作用，與人類免疫、癌癥、Ⅱ型糖尿病、腎臟疾病等有關(guān)［50］。文蛤組織蛋白酶B（MmeCB）的 cDNA全長(zhǎng)1 647 bp，開放閱讀框1 014 bp，編碼337個(gè)氨基酸，MmeCB分子量約為37．3 kDa，pI 5．50，具有 3個(gè)保守氨基酸殘基（Cys-111、His-282和 Asn-302），序列與哺乳動(dòng)物組織蛋白酶B有55%的同源性。文蛤Cathepsin B基因在大腸桿菌中表達(dá)，純化后獲得重組的文蛤組織蛋白酶B（rMmeCB），酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果為 rMmeCB的 Km、Vmax和 Kcat分別是6．11μM、0．017 4μM·min-1和 277．57·s-1。

2．4 谷胱甘肽過氧化物酶

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，也是催化谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷囊环N金屬酶，通過減少脂質(zhì)過氧化物和自由過氧化氫來(lái)保護(hù)生物體免受氧化損傷［51］。文蛤谷胱甘肽過氧化物酶（MmeGPx）基因包含723 bp和238 bp的2個(gè)內(nèi)含子，開發(fā)閱讀框711 bp，編碼237個(gè)氨基酸的蛋白，序列分析MmeGPx與人的GPx 3高度相似。

圖1 文蛤溶菌酶及抑制劑結(jié)構(gòu)圖Fig．1 Structure of lysozyme and inhibitor from M．meretrix

2．5 N-羥甲基-L-丙氨酸脫氫酶

LEE等［52］從文蛤中分離純化了N-羥甲基-L-丙氨酸脫氫酶（strombine dehydrogenase，SDH），具體方法是采用硫酸銨沉淀、Sephacryl S-100凝膠過濾色譜、羥基磷灰石色譜、離子交換色譜DEAE-Sepharose和親和色譜等多個(gè)色譜程序，最終純化了文蛤SDH并研究了酶學(xué)特性，該酶分子量為46 kDa，純度提高了470倍，最適pH 7．4～7．6，最適作用溫度45～46°C。

除以上分離純化或克隆鑒定的5種主要的文蛤酶以外，還有學(xué)者經(jīng)過測(cè)定發(fā)現(xiàn)在文蛤組織中還含有乳酸脫氫酶、抗氧化酶等，但是尚未分離純化得到純酶，也未克隆得到其全序列。近年來(lái)有學(xué)者克隆了文蛤組蛋白去乙?；?基因（HDAC1）、磺基轉(zhuǎn)移酶基因（SULT）、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶 9（FBA）基因［53］等。

3 文蛤生物活性多肽（蛋白）制備方法

文蛤活性多肽（蛋白）通過以下3種方法得到：1）提取分離純化，主要采用硫酸銨沉淀，離子交換色譜、凝膠過濾色譜和HPLC，對(duì)精制得到的文蛤多肽（蛋白）進(jìn)行活性和功能評(píng)價(jià)；該步驟為傳統(tǒng)方法，方法穩(wěn)定，結(jié)果可靠，預(yù)期可控制，但過程繁瑣，目標(biāo)多肽（蛋白）得率較低。2）分子克隆得到cDNA序列，推導(dǎo)出氨基酸序列，氨基酸組成數(shù)目較少的多肽再通過化學(xué)合成得到蛋白，部分通過克隆表達(dá)得到文蛤多肽（蛋白），然后再分析其活性和功能；該方法可以避免天然文蛤多肽（蛋白）提取純化中的諸多不足。3）水解文蛤肉，然后分離純化鑒定，在抗氧化多肽、ACE抑制肽的制備中應(yīng)用較多，用酶催化水解文蛤蛋白，使整合在蛋白質(zhì)分子中的多肽序列釋放出來(lái)，具有各種生物活性；酶水解包括使用單一酶或復(fù)合酶對(duì)蛋白進(jìn)行水解，其中利用復(fù)合酶水解蛋白時(shí)可采用順序加入或同時(shí)加入的方式進(jìn)行水解。

4 展望

文蛤資源豐富，主要分布于東南亞國(guó)家沿海一帶，其軟體部富含多種生物活性物質(zhì)而備受國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的重視，目前研究已取得了豐碩的成果，但要進(jìn)一步推動(dòng)文蛤活性肽／蛋白開發(fā)應(yīng)用尚存在一些需要解決的問題：1）文蛤體內(nèi)活性物質(zhì)種類多，但對(duì)已發(fā)現(xiàn)的各種文蛤活性肽的作用機(jī)制、藥理作用及開發(fā)應(yīng)用未能深入研究，僅對(duì)文蛤抗腫瘤肽進(jìn)行了深入研究，對(duì)其它成分及活性研究還不夠深入，如發(fā)現(xiàn)的幾十種文蛤多肽（蛋白），僅對(duì)文蛤溶菌酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析；2）因?yàn)槲母蛏L(zhǎng)分布地域的特點(diǎn)，研究者主要集中在中國(guó)和東南亞少數(shù)幾個(gè)國(guó)家，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)國(guó)際合作，讓更多的國(guó)家和研究者參與進(jìn)來(lái)，使文蛤基礎(chǔ)科學(xué)研究再上臺(tái)階；3）文蛤肉富含多種活性蛋白質(zhì)或多肽，貝殼中含有豐富的礦物元素，應(yīng)重視綜合利用；4）以文蛤作為傳統(tǒng)中藥和民間秘方為基礎(chǔ)，加強(qiáng)文蛤藥物的開發(fā)和市場(chǎng)推廣，并對(duì)文蛤作為中藥的抗病作用機(jī)制開展進(jìn)一步探討。