二甲雙胍通過三羧酸循環(huán)途徑對巨噬細(xì)胞線粒體功能的影響

冀東，黃曉晨，朱長太

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院； 2.上海市第六人民醫(yī)院 東院輸血科， 上海 201306)

炎癥是機(jī)體受到外界刺激時所產(chǎn)生的損傷和抗損傷的雙重反應(yīng)，過度或持續(xù)的炎癥反應(yīng)可引起組織損傷和機(jī)能障礙[1]，如癌癥、動脈粥樣硬化、敗血癥等[2].巨噬細(xì)胞作為天然免疫中的重要組成部分，在組織損傷修復(fù)、炎癥與感染以及代謝等方面發(fā)揮著重要作用[3].巨噬細(xì)胞受到環(huán)境的影響被激活后主要分為2種類型：經(jīng)典活化型(M1)和替代活化型(M2).M1主要由γ干擾素和Toll樣受體信號通路激活引起，分泌促炎炎性因子，發(fā)揮著抗感染等作用；而M2主要由白細(xì)胞介素IL-4和IL-13刺激引起，分泌抑炎炎性因子，發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤、損傷修復(fù)等作用[4].線粒體作為細(xì)胞代謝的重要場所，對巨噬細(xì)胞發(fā)揮著重要的調(diào)控作用.線粒體是機(jī)體主要的代謝細(xì)胞器，也是體內(nèi)關(guān)鍵代謝通路的集成者，這些代謝通路包括氧化磷酸化、脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycling，TCA)通路等，線粒體對細(xì)胞代謝、體內(nèi)平衡和應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要，這些功能已成為介導(dǎo)代謝疾病、癌細(xì)胞代謝、神經(jīng)變性和衰老的關(guān)鍵因素.線粒體自噬是降解線粒體的唯一機(jī)制，主要清除受損或功能失調(diào)的線粒體，用于控制線粒體的質(zhì)量[5]，影響多種細(xì)胞反應(yīng)，如代謝平衡、細(xì)胞命運和炎癥.TCA循環(huán)是線粒體產(chǎn)能的關(guān)鍵通路，線粒體能量供應(yīng)不足會導(dǎo)致心臟、肌肉和大腦等高能量需求的器官和組織的功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致人類疾病，包括阿爾茨海默氏病、帕金森病等疾病[6].二甲雙胍(metformin，Met)是治療2型糖尿病的一線藥物，除具有降血糖作用外，還具有抗炎、抗衰老等功效[7]，其作用機(jī)制是能降低多種促炎炎性因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫細(xì)胞分化，目前研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍在肥胖中起到的抗炎作用主要通過將巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為M2型來改善反應(yīng)[8].

目前尚未有TCA循環(huán)對巨噬細(xì)胞線粒體功能影響的深入報道，本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)營造炎癥環(huán)境，Met營造抗炎環(huán)境，就TCA循環(huán)在炎癥與抗炎環(huán)境下對線粒體功能的影響進(jìn)行探討，以分析在不同形態(tài)的巨噬細(xì)胞中TCA循環(huán)的變化情況，以及相應(yīng)的變化對線粒體功能造成的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

脂多糖(LPS，055：B5)，二甲雙胍(Met)購自美國Sigma 公司;RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;DMEM低糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清，雙抗購自美國Gibco公司；抗體iNOS(ab178945)、CS(ab129095)、OGDH(ab137773)、IDH2(ab131263)、MDH2(ab181873)、Beclin-1(ab207612)、LC3b(ab204297)、GAPDH(ab181602)購自英國Abcam公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent購自中國Vazyme公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit，熒光定量PCR試劑盒SuperReal PreMix Plus購自中國Tiangen公司；活性氧檢測試劑盒Reactive Oxygen Species Assay Kit購自中國上海翊圣生物科技有限公司(50101ES01).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于添加青霉素(質(zhì)量濃度100 IU/mL)、鏈霉素(質(zhì)量濃度100 μg/mL)以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%熱滅活胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)95%空氣、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗.

1.3 Real-time PCR

取對數(shù)期 RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于6孔板，細(xì)胞密度為 5×105/mL，每孔2 mL，培養(yǎng) 24 h貼壁后，設(shè)置空白對照組、LPS組、Met+LPS對照組，LPS的質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，Met的濃度采用已有文獻(xiàn)的濃度，均為5 mmol/L[9]，Met于LPS前1 h加入，加入LPS刺激8 h.使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA， 用紫外分光光度計檢測所提RNA濃度及純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將 RNA為模版逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，實時定量PCR采用SYBR Green法.采用2-ΔΔCt方法對 qPCR 結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.本實驗研究中的引物均由中國BioTNT公司合成，引物序列見表1.

表1 本研究使用的相關(guān)引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.4 Western blot印跡檢測

取對數(shù)期 RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于 6 孔板，細(xì)胞密度為 5×105/mL，每孔2 mL，培養(yǎng) 24 h貼壁后，設(shè)置空白對照組、LPS組、Met+LPS對照組，LPS的質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，Met的濃度均為5 mmol/L，Met于LPS前1 h加入，加入LPS刺激8 h.用三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline，TBS)洗兩遍，加入適量的蛋白裂解液，收集細(xì)胞蛋白，定量，等量蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS PAGE)，半干轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗 4 ℃過夜，洗膜緩沖液(tris buffered saline Tween， TBST)洗膜3次，然后將其放入用TBS稀釋的二抗(體積比為1∶5 000)中，TBST洗膜3次，最后使用Amersham Imager600顯影儀顯色.各蛋白稀釋的體積比如下：CS(1∶1 000)，OGDH(1∶1 000)，MDH2(1∶10 000)，Beclin-1(1∶2 000)，ACC(1∶1 000)，LC3b(1∶1 000)，iNOS(1∶1 000)，IDH2(1∶1 000)，GAPDH(1∶10 000).

1.5 線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)的測定

取對數(shù)期 RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于 6 孔板，細(xì)胞密度為 5×105/mL，每孔 2 mL，培養(yǎng) 24 h貼壁后，設(shè)置空白對照組、LPS組、Met+LPS對照組，LPS的質(zhì)量濃度均為1μg/mL，Met的濃度均為5 mmol/L，Met于LPS前1 h加入，加入LPS刺激8 h.按照1∶1 000的體積比用無血清的培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L.將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸.用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1～2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA.洗滌及細(xì)胞重懸后利用流式細(xì)胞儀檢測各組的相對熒光強(qiáng)度，F(xiàn)ITC熒光信號激發(fā)波長488 nm, 發(fā)射波長525 nm，所檢測的相對熒光強(qiáng)度可間接反映出細(xì)胞內(nèi)的ROS水平.實驗重復(fù)3次.

1.6 JC-1線粒體膜電位(JC-1 mitochondrial membrane potential，MMP)的測定

取對數(shù)期 RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于 6 孔板，細(xì)胞密度為 5×105/mL，每孔 2 mL，培養(yǎng) 24 h貼壁后，設(shè)置空白對照組、LPS組、Met+LPS對照組，LPS的質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，Met的濃度均為5 mmol/L，Met于LPS前1 h加入，加入LPS刺激8 h.將收集好的細(xì)胞用體積為0.5 mL的JC-1 染色工作液重懸，混勻后于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min.孵育結(jié)束后， 4 ℃ 600g離心3 min，沉淀細(xì)胞，棄上清，用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌兩次，并用適量重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀分析，F(xiàn)ITC熒光信號在488 nm處激發(fā)，530 nm處檢測到，PE熒光信號在530 nm處激發(fā)，630 nm處檢測到.實驗重復(fù)3次.

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 線粒體活性氧檢測的結(jié)果

ROS是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，其主要來源是線粒體代謝的副產(chǎn)品，中、高濃度的ROS通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死，低濃度的ROS對轉(zhuǎn)錄因子的激活以及對細(xì)胞增殖、分化有促進(jìn)作用，線粒體功能障礙的典型癥狀是高ROS的生成.LPS刺激8 h后線粒體ROS升高，此時線粒體功能受到損傷，Met抗炎后線粒體ROS下降，線粒體狀態(tài)趨于穩(wěn)定(圖1).

與空白組比較 1)P<0.05; 與LPS實驗組比較 2)P<0.05.Compared with normal control group, 1)P<0.05; Compared with LPS group, 2)P<0.05.

2.2 Real-time PCR結(jié)果

為確定LPS引起巨噬細(xì)胞炎癥狀態(tài)的反應(yīng)時間，設(shè)置時間梯度，選擇0、2、4、8、24 h時間點.IL-1β與IL-6是免疫細(xì)胞分泌的一系列重要炎癥因子.與空白組比，隨著LPS刺激的時間增加，IL-1β與IL-6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有顯著表達(dá)(圖2)，巨噬細(xì)胞出現(xiàn)炎癥狀態(tài)，加藥8 h后巨噬細(xì)胞炎癥狀態(tài)最為顯著，因此后續(xù)實驗選擇該時間點進(jìn)行炎癥與抗炎實驗.

與空白組比，隨著LPS刺激的時間增加，檸檬酸合酶(citrate synthase，CS)、異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)、蘋果酸脫氫酶(malic dehydrogenase， MDH2)、α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase， OGDH)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后降低，在LPS刺激8 h時上述酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)全部降低(圖3)，即當(dāng)在LPS刺激8 h的炎癥狀態(tài)下TCA循環(huán)通路的活性降低，因此后續(xù)實驗選定8 h時間點.

與空白組比較 1)P<0.000 1, 2)P<0.01， 3)P<0.05.

Compared with normal control group, 1)P<0.000 1， 2)P<0.01， 3)P<0.05.

A: LPS刺激巨噬細(xì)胞后IL-1β的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間的變化趨勢；B:LPS刺激巨噬細(xì)胞后IL-6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間的變化趨勢.

A: Trend of IL-1βmass fraction over time after LPS stimulation of macrophages; B: Trend of IL-6 mass fraction over time after LPS stimulation of macrophages.

圖2 LPS引起巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)隨時間的變化趨勢

Fig.2 The change trend of macrophage inflammatory response induced by LPS with time

與空白組比較 1)P<0.000 1， 2)P<0.01， 3)P<0.05.

Compared with normal control group, 1)P<0.000 1， 2)P<0.01， 3)P<0.05.

A: LPS對CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響隨時間的變化趨勢；B: LPS對IDH2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響隨時間的變化趨勢；C: LPS對MDH2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響隨時間的變化趨勢；D: LPS對OGDH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響隨時間的變化趨勢.

A: The change trend of the influence of LPS on CS mass fraction with time; B: The change trend of the influence of LPS on IDH2 mass fraction with time; C: The change trend of the influence of LPS on MDH2 mass fraction with time; D: The change trend of the influence of LPS on OGDH mass fraction with time.

圖3 LPS對TCA循環(huán)通路中關(guān)鍵酶的影響隨時間的變化趨勢

Fig.3 The influence of LPS on the key enzymes in the TCA cycle pathway changes with time

與空白組比，在LPS質(zhì)量濃度1 μg/mL刺激8 h時，LPS刺激細(xì)胞后，極大地提高了IL-6、IL-1β、IL-10這3種炎癥因子的mRNA表達(dá)水平，說明LPS刺激可以造成巨噬細(xì)胞炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的顯著上升，這與模型建立的結(jié)果一致. 與LPS組相比，Met對上述促炎炎性因子IL-6、IL-1β有抑制作用，表達(dá)量降低，抑炎炎性因子IL-10表達(dá)量升高，即Met濃度為5 mmol/L抑制住炎癥[9](圖4).

與空白組比較 1)P<0.000 1, 2)P<0.01, 3)P<0.05; 與LPS實驗組比較1)P<0.000 1, 2)P<0.01， 3)P<0.05.

Compared with control group, 1)P<0.000 1, 2)P<0.01, 3)P<0.05; Compared with LPS group, 1)P<0.000 1, 2)P<0.01， 3)P<0.05.

A: Met抗炎后IL-1β的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；B:Met抗炎后IL-6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；C：Met抗炎后IL-10的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

A: Mass fraction of IL-1β after Met anti-inflammatory; B: Mass fraction of IL-6 after Met anti-inflammatory; C: Mass fraction of IL-10 after Met anti-inflammatory.

圖4 Met對RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)的影響

Fig.4 Effects of Met on the expression of RAW264.7 cytokine genes

與空白組比，在LPS 質(zhì)量濃度1 μg/mL刺激8 h的炎癥狀態(tài)下，TCA循環(huán)通路中的關(guān)鍵酶CS、IDH2、MDH2、OGDH表達(dá)水平均降低；與LPS對照組相比，當(dāng)炎癥抑制住后，TCA循環(huán)通路中的關(guān)鍵酶CS、IDH2、MDH2、OGDH表達(dá)水平均有所回升(圖5).

2.3 Western blot印跡檢測結(jié)果

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，iNOS)作為重要的炎性介質(zhì)一氧化氮(nitric oxide，NO)生成的關(guān)鍵限速酶，其基因表達(dá)水平是調(diào)控NO 釋放的重要因素，通過檢測iNOS 蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LPS可顯著上調(diào)iNOS 的表達(dá)，即此時炎癥狀態(tài)顯著，而Met能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)量，即此時炎癥狀態(tài)被抑制(圖6A).

TCA循環(huán)通路中的關(guān)鍵酶MDH2、OGDH、CS、IDH2在炎癥狀態(tài)下表達(dá)量下降，在炎癥抑制住時表達(dá)量有所回升，即TCA循環(huán)在炎癥狀態(tài)下會被抑制，在抗炎狀態(tài)下會被修復(fù)(圖6B).

線粒體自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3bI在炎癥狀態(tài)下表達(dá)量下降，在Met作用的抗炎狀態(tài)下表達(dá)量持續(xù)下降，即炎癥狀態(tài)TCA循環(huán)減弱時線粒體自噬功能受到抑制，濃度為5 mmoL/L的Met對線粒體自噬功能也有一定的抑制作用(圖6C).

2.4 線粒體膜電位檢測的結(jié)果

線粒體在產(chǎn)生能量時會將電化學(xué)勢能儲存于線粒體內(nèi)膜，在內(nèi)膜兩側(cè)，若質(zhì)子及其他離子濃度的不對稱分布就會形成線粒體膜電位，正常的膜電位是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件,膜電位的穩(wěn)定有利于維持細(xì)胞的正常生理功能，LPS刺激8 h后線粒體膜電位升高，此時線粒體功能受到損傷，Met抗炎后線粒體膜電位去極化，線粒體狀態(tài)趨于穩(wěn)定(圖7).

2.5 討論

在炎癥狀態(tài)下TCA循環(huán)通路被破壞，ROS生成量增加，線粒體膜電位升高.而線粒體ROS的增加會抑制氧化磷酸化和ATP生成，導(dǎo)致能量代謝失衡[10]，因此極有可能是由于氧化磷酸化的減少，TCA循環(huán)被破壞.自噬對免疫反應(yīng)的影響是復(fù)雜的，自噬可以通過調(diào)節(jié)病原體清除、抗原表達(dá)、先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)來促進(jìn)或減少炎癥[11]，而高ROS會損壞線粒體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致線粒體自噬功能減弱. α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase， OGDH)的缺失導(dǎo)致α-酮戊二酸(OGDH的底物)的增加，其反過來導(dǎo)致mTORC1活化和隨后的線粒體自噬減少，導(dǎo)致線粒體代謝功能障礙[5].在Met抗炎后，M2型細(xì)胞增多，ROS生成量降低，線粒體膜電位降低，TCA循環(huán)可能是受氧化磷酸化增多的β氧化而回升.有研究表明，在不同形態(tài)的巨噬細(xì)胞中，線粒體自噬功能有差異[12]，在M1型巨噬細(xì)胞中線粒體自噬功能強(qiáng)，在M2型巨噬細(xì)胞中線粒體自噬功能會減弱，因此在Met抗炎后，由于M2型細(xì)胞增多，線粒體自噬功能減弱更為嚴(yán)重.在細(xì)胞外ATP水平較高時會誘導(dǎo)ATP產(chǎn)生促炎作用，這種促炎作用出現(xiàn)在炎癥的早期階段[13]，在炎癥過程的最后， ATP去磷酸化酶破壞ATP和炎癥部位細(xì)胞產(chǎn)生腺苷，這將導(dǎo)致ATP水平下降和腺苷水平增加[14].

與空白組比較 1)P<0.000 1，3)P<0.01; 與LPS實驗組比較 2)P<0.000 1，4)P<0.05.

Compared with control group, 1)P<0.000 1，3)P<0.01; Compared with LPS group, 2)P<0.000 1，4)P<0.05.

A: Met抗炎后CS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；B: Met抗炎后IDH2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；C: Met抗炎后MDH2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；D: Met抗炎后OGDH的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

A: Mass fraction of CS after Met anti-inflammatory; B: Mass fraction of IDH2 after Met anti-inflammatory; C: Mass fraction of MDH2 after Met anti-inflammatory; D: Mass fraction of OGDH after Met anti-inflammatory.

圖5 炎癥與抗炎對TCA循環(huán)通路中關(guān)鍵酶的影響

Fig.5 Effect of inflammation and anti-inflammatory on key enzymes in TCA circulation pathway

二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線藥物，除具有降血糖的作用外，還具有抗炎等功效，其作用機(jī)制是能降低多種促炎炎性因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)抗炎炎性因子介導(dǎo)免疫細(xì)胞分化.有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化抑制腫瘤發(fā)生和分化[15].TCA循環(huán)是線粒體中產(chǎn)能的關(guān)鍵通路，因此線粒體能量供應(yīng)不足會導(dǎo)致心臟、肌肉和大腦等高能量需求的器官和組織的功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致人類疾病，包括阿爾茨海默氏病、帕金森病等疾病.二甲雙胍可以修復(fù)受損的TCA循環(huán)，使線粒體功能趨于穩(wěn)定.

M1型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為TCA循環(huán)中斷，參與促炎反應(yīng)和殺死細(xì)胞內(nèi)病原體[16]，相反，M2型巨噬細(xì)胞發(fā)生β-氧化產(chǎn)生抗炎反應(yīng)，促進(jìn)傷口愈合[17].有研究表明，TCA循環(huán)通路在M1型巨噬細(xì)胞中發(fā)生兩次循環(huán)中斷[18]，首次斷裂發(fā)生在涉及異檸檬酸脫氫酶的步驟，第2次斷裂發(fā)生在涉及琥珀酸脫氫酶的步驟.依賴于線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的IDH2通過調(diào)節(jié)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的產(chǎn)生，在線粒體氧化還原平衡的控制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19].敗血癥是非冠狀動脈重癥監(jiān)護(hù)病的主要死亡原因，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率不斷上升.敗血癥中巨噬細(xì)胞線粒體損傷的機(jī)制包括產(chǎn)能缺陷、細(xì)胞凋亡和炎癥誘導(dǎo)，敗血癥期間線粒體ROS的增加會抑制氧化磷酸化和ATP生成，導(dǎo)致能量代謝失衡，引起全身炎癥和多器官衰竭，ROS會損害線粒體結(jié)構(gòu)，并阻止線粒體的生物發(fā)生.最近與IDH2相關(guān)的研究集中在其于癌癥發(fā)展中的作用，包括乳腺癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤[20]，IDH2突變導(dǎo)致多種癌癥，包括炎癥紊亂，最近的研究將各種癌癥中IDH2的功能障礙與炎癥反應(yīng)的失調(diào)聯(lián)系起來，如促炎炎性因子的過度產(chǎn)生[21]，單核細(xì)胞中，敗血癥患者的CS活性最高水平顯著低于正常人[22]，由此推測TCA循環(huán)通路中關(guān)鍵酶的表達(dá)量下降會導(dǎo)致活性氧增加，從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，這也有可能是導(dǎo)致敗血癥的原因，在肝臟中炎癥反應(yīng)加劇了線粒體蛋白的乙?；?，MDH2被乙酰化，并且刺激蘋果酸-天冬氨酸穿梭活性以維持糖酵解[23]， OGDH是一種關(guān)鍵的代謝中間體，可作為促炎代謝物，通過NF-κB信號通路增加LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，當(dāng)IDH2缺失時會導(dǎo)致OGDH的表達(dá)量下降，最終降低了LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)[24].

與空白組比較 1)P<0.01; 與LPS實驗組比較 2)P<0.01.

Compared with control group, 1)P<0.01;Compared with LPS group, 2)P<0.01.

圖6A iNOS表達(dá)量

Fig.6A The expression of iNOS

與空白組比較 1)P<0.01;與LPS實驗組比較 2)P<0.01， 3)P<0.05.

Compared with control group, 1)P<0.01;Compared with LPS group, 2)P<0.01， 3)P<0.05.

圖6B TCA循環(huán)通路中的關(guān)鍵酶在炎癥與抗炎狀態(tài)下的變化

Fig.6B Changes of key enzymes in the TCA circulation pathway in inflammatory and anti-inflammatory states

與空白組比較 1)P<0.01; 與LPS實驗組比較 2)P<0.01.

Compared with control group, 1)P<0.01;Compared with LPS group, 2)P<0.01.

圖6C 自噬相關(guān)蛋白在炎癥與Met抗炎條件下的表達(dá)情況

Fig.6C Expression of autophagy related proteins in inflammatory and Met anti-inflammatory conditions

與空白組比較 1)P<0.05; 與LPS實驗組比較 2)P<0.000 1.Compared with control group, 1)P<0.05; Compared with LPS group, 2)P<0.000 1.

3 結(jié)論

綜上所述，線粒體中的TCA循環(huán)在炎癥狀態(tài)下會被破壞，造成線粒體能量代謝失衡，損壞線粒體結(jié)構(gòu)；Met能夠抑制炎癥，加劇減弱線粒體自噬功能，同時抗炎狀態(tài)會對被抑制的TCA循環(huán)起到修復(fù)作用，使線粒體功能趨于穩(wěn)定.因此TCA循環(huán)的變化對線粒體功能的改變起到十分重要的作用，但在炎癥與抗炎環(huán)境下TCA循環(huán)對線粒體功能影響的機(jī)制尚不清楚，后續(xù)需要進(jìn)一步研究TCA循環(huán)影響線粒體功能的機(jī)制、作用靶點，以及TCA循環(huán)是如何影響線粒體的功能.