25種無花果種質(zhì)資源SSR分析

(唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

無花果(FicuscaricaL.)又名奶漿果、映日果、蜜果等，隸屬?？?Moraceae)榕屬(FicusL.)植物，多為落葉喬木或灌木[1]，原產(chǎn)于地中海沿岸，唐代開始引入我國栽培，目前主要分布于新疆、山東、江蘇、上海等地區(qū)[2-3]。由于無花果主要以扦插、分株等無性繁殖為主，20世紀(jì)90年代以來又從國外引入一些新品種，從而造成品種間混淆、品種之間親緣關(guān)系不清楚，依靠過去的從形態(tài)上進(jìn)行品種區(qū)分，已經(jīng)很難做出準(zhǔn)確的判斷[3]。用分子標(biāo)記的方法對無花果進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定前人已有研究，如王亮等對山東省的無花果種質(zhì)資源進(jìn)行了RAPD分析[4]，郭正兵采用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法分析了30份無花果品種的遺傳多樣性[3]。由于我國無花果品種近千種，具有推廣價(jià)值的近100種，因此對無花果品種之間的親緣關(guān)系鑒定還是一項(xiàng)重要的課題。

SSR(simple sequence repeats,SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，SSR分子標(biāo)記技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，是一種在基因組內(nèi)廣泛分布的高多態(tài)性標(biāo)記，擁有共顯性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)[5]，廣泛應(yīng)用于品種鑒定[6]、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究[7]、遺傳多樣性研究[8-10]、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[11]和分子標(biāo)記輔助育種[12]等領(lǐng)域。本文運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對來自河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所在國內(nèi)搜集的25種無花果種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性方面的初步研究，25個(gè)無花果品種主要來源于美國、日本、法國、意大利等國家，其中7個(gè)品種(青皮、A 1213、布蘭瑞克、以色列、紫陶芬、金傲芬、瑪斯義陶芬)的親緣關(guān)系在郭正兵等[3]的研究中已有報(bào)道，本試驗(yàn)進(jìn)一步對25種無花果種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，旨在了解其資源的分布與演化程度，為無花果資源保存與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用25種無花果：砂糖、焦黑、日黑、圣果、維尼、紅果、蓬萊柿、芭勞奈、青皮、白亞、土耳其、夫人、西萊、法紫、美味華麗、A 1213、龍波、布蘭瑞克、以色列、紫陶芬、皮特、金傲芬、拉魯高、瑪斯義陶芬、紅矮生(從左到右依次編號為1～25)。由河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所提供。

1.2 試劑和儀器

1.2.1試 劑

異丙醇、氯仿、無水乙醇、DNA快速提取試劑盒均購自上海生物工程股份有限公司(上海)。SSR-PCR擴(kuò)增所用的2×Taq PCR Mastermix購自北京天根生化科技有限公司。

1.2.2儀 器

大型冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、96孔PCR儀(Applied biosystems)。

1.3 方 法

1.3.1DNA提取

利用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，試劑盒主要成分為CTAB。

1.3.2SSR引物

20對引物選取參考郭正兵等[3]的報(bào)道，委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行合成，引物名稱和序列見表1。

1.3.3PCR擴(kuò)增

SSR-PCR擴(kuò)增體系(20μL)：DNA模版2μL，上游引物0.8μL(100μmol·L-1)，下游引物0.8μL(100μmol·L-1)，2×Taq PCR Mastermix 10μL，ddH2O 6.4μL。SSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，45～55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[14]。

1.3.4SSR-PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠檢測

SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，在8%的聚丙烯酰胺凝膠中檢測，然后銀染法顯色，拍照并記錄結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將電泳圖譜清晰且可重復(fù)的條帶賦值為1，同一位置上未出現(xiàn)條帶的賦值為0，形成1，0數(shù)據(jù)矩陣，用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到遺傳距離，用UPGMA(非加權(quán)組平均法)進(jìn)行聚類分析。

表1 SSR分析所用引物編號和序列[3]

引物編號序列(5’-3’)FCUP038-6FCAATGTATCATTTCATCTCACGAAFCUP038-6RAGTTCCCATGTTTGGTTACTGAFCUP044-6FGCTCGCCTTTCTAACATGGAFCUP044-6RAACTTTCATTCATTGCGGAAAFCUP045-6FTTCCAAGGCATATTATGTTGAAAFCUP045-6RGTCCAAGGCAAATGATGAAFCUP066-7FCCCTCTCGAAGAAGAAGCAFCUP066-7RCTACAGGAAATGGGCCTCAAFCUP069-6FCCGGAAACACACAAATTCAAFCUP069-6RCAAAGCGTCGACTCACTGAAMFC2FGCTTCCGATGCTGCTCTTAMFC2RTCGGAGACTTTTGTTCAATMFC7FCACAATCAAAATAGTTACCGMFC7RAGCGAAGACAGTTACAAAGCMFC8FGTGGCGTCGTCTCTAATAATMFC8RTATTCTATGCTGTCTTATGTCALMFC17FTTAAGAATACGTCCTTGGTATLMFC17RGAGATTTCGTTGACTTCATTLMFC19FCTTATGAAAACTCGGTAGAAGLMFC19RAATGAATGGAAATGATCTTGLMFC27FATTTCTTCAACTTTTGTAATGALMFC27RCCTTTTGTCTACATATACCTTTLMFC28FTGATTCCTTTTACTTGTAGATTLMFC28RAAGACATTGAGACATACCAGLMFC30FTTGTCCGTTTCTTATACAATLMFC30RTCTTTTTAGGCAGATGTTAGLMFC37FAAGTACATCTTCACCATTGALMFC37RATTAAACTCTTCATTCATCAGTLMFC38FCTCAACGTCCGTACTAACTALMFC38RCTAAGGAATAAAAGGAGAAAAMFC1FACTAGACTGAAAAAACATTGCMFC1RTGAGATTGAAAGGAAACGAGMFC3FGATATTTTCATGTTTAGTTTGMFC3RGAGGATAGACCAACAACAACMFC4FCCAAACTTTTAGATACAACTTMFC4RTTTCTCAACATATTAACAGGMFC5FACCAATCCAAATAATAATCCMFC5RACACGCTTACTAGAATTACCMFC6FAGGCTACTTCAGTGCTACAMFC6RGCCATAAGTAATAAAAACC

2 結(jié)果與分析

2.1 25種無花果基因組DNA提取

將提取出來的25種無花果基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明，25種無花果樣品的基因組DNA條帶清晰，基本無彌散(圖1)，說明所提取DNA質(zhì)量較好，純度可靠可用于進(jìn)一步的分析。

圖1 無花果基因組DNA圖譜

圖3 引物L(fēng)MFC 38 F/38 R對25種無花果的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 SSR引物對25種無花果的擴(kuò)增

用20對引物在25種無花果樣品中共擴(kuò)增出95條帶，其中多態(tài)性帶83條，多態(tài)性比率為87.37%，平均每對引物擴(kuò)增出4.75個(gè)多態(tài)性條帶，引物MFC 2 F/2 R擴(kuò)增條帶數(shù)最多，共擴(kuò)增出10條帶，其中多態(tài)性條帶為8，引物FC 19 F/19 R只擴(kuò)增1條多態(tài)性條帶，條帶數(shù)最少(表2)。

表2 20對SSR引物在25種無花果材料中的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析

引物擴(kuò)增條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)多態(tài)性條帶比例/%FCUP038-6F/R8787.50FCUP044-6F/R5480.00FCUP045-6F/R5360.00FCUP066-7F/R77100.00FCUP069-6F/R22100.00MFC2F/R10880.00MFC7F/R88100.00MFC8F/R2150.00LMFC17F/R33100.00LMFC19F/R11100.00LMFC27F/R55100.00LMFC28F/R22100.00LMFC30F/R33100.00LMFC37F/R5480.00LMFC38F/R22100.00MFC1F/R44100.00MFC3F/R4125.00MFC4F/R55100.00MFC5F/R6583.33MFC6F/R88100.00合計(jì)958387.37

注：多態(tài)性條帶比例=多態(tài)性條帶數(shù)/擴(kuò)增條帶數(shù)。

2.3 25種無花果材料的遺傳距離分析

利用20對SSR引物在25種無花果樣品中擴(kuò)增到的95條帶計(jì)算樣品間的遺傳距離，由表3可見，25個(gè)無花果樣品間的遺傳距離在0.20～1.00之間，其中以色列和馬斯義陶芬遺傳距離最小，為0.20，親緣關(guān)系最近；西萊和維尼、蓬萊柿、美味華麗、布蘭瑞克、金傲芬、馬斯義陶芬這6個(gè)品種的遺傳距離均為1，遺傳距離最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4 25種無花果的聚類分析

20對SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，從圖2可看出，25種無花果樣品都聚在遺傳距離為0.20～1.00類群中。在遺傳距離為0.77處，可將供試的25種無花果分為3大類，第1大類僅包括西萊這一品種，第2大類包括砂糖、日黑、法紫、美味華麗，其他品種歸為第3大類。

圖2 25種無花果樣品SSR分析的聚類圖

2.5 SSR分子標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定

電泳結(jié)果中的特異性條帶，可作為一種分子標(biāo)記來進(jìn)行品種鑒定。本實(shí)驗(yàn)中，引物對LMFC 38 F/38 R在大約200 bp的條帶可作為鑒定23號無花果的分子標(biāo)記(圖3)，而引物對MFC 1 F/1 R在100-250 bp條帶可鑒定出19號無花果(圖4)。

表3 基于SSR引物計(jì)算的25種無花果樣品的遺傳距離

No.12345678910111213141516171819202122232420.68830.6670.76540.6670.5710.66750.6900.4210.7330.51660.7940.3850.8290.4690.40570.7780.3080.7780.6320.3680.41580.7950.3570.8540.6250.4880.3000.26890.6820.4550.7390.4580.6570.4850.5680.600100.5710.4710.7500.5390.5460.5430.5410.5000.607110.7500.4500.8240.5000.4320.3060.4760.3250.5150.438120.7830.5290.7270.5600.6470.7110.5950.6250.6300.6430.588130.9090.9700.9090.9471.0000.9691.0000.9740.9500.9520.9680.947140.7650.7350.6000.6820.7810.8000.7840.8000.7500.7600.7940.5500.818150.7690.8490.6670.8570.8280.9120.8570.9250.8640.9170.9410.8001.0000.692160.7080.4860.6520.4400.6000.5950.5140.6190.5190.5360.5830.4400.9550.5460.714170.7220.2560.7900.5790.4000.4050.3330.3410.5530.5260.3500.5000.9730.7300.8330.460180.8110.4650.7780.5950.4500.4150.4190.4220.5280.6150.4000.6671.0000.7840.8890.6250.372190.7140.4050.8460.7070.5000.4650.3570.2860.5790.6250.4520.6410.9720.7900.8610.6000.3490.467200.7740.4620.8130.5630.4870.4050.5240.4880.5760.6290.3430.6060.9660.7810.8670.5590.3160.4880.385210.6880.3590.8000.5710.3330.3420.4290.4320.5830.5140.3680.6840.9700.7710.8490.5680.3000.4290.3660.235220.8110.3900.8420.6670.4880.4150.3810.3860.6050.7140.4390.6671.0000.8160.8570.5900.2930.3420.3170.2780.350230.8250.4670.8540.6590.5230.4890.3860.4260.5640.6100.4770.6590.9740.8290.8970.5500.3780.4220.4350.4520.4670.386240.7750.4570.8860.6430.4770.3720.3780.2730.5500.5610.3950.6740.9750.8100.9020.6050.3330.3780.1950.4050.3490.3410.311250.7590.5500.7590.5810.4570.4600.5000.5680.5940.6470.4440.6671.0000.7240.8150.5310.4500.4210.4750.3640.3430.3780.5350.452

圖4 引物MFC 1 F/1 R對25種無花果的擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

無花果的分類大多依據(jù)葉形、果皮顏色、果形大小等進(jìn)行分類，經(jīng)常會發(fā)生品種資源的混淆，導(dǎo)致同種異名或異種同名，因此，有必要采用分子鑒定方法對其進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。SSR技術(shù)作為常用的一種分子標(biāo)記，能進(jìn)行種質(zhì)資源和遺傳多樣性的分析。國外已有許多學(xué)者利用SSR分子標(biāo)記對無花果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。如Perez-Jiménez等[13]利用21對SSR引物對西班牙南部的42種無花果進(jìn)行了遺傳多樣性分析，通過聚類分析將其分成3大類，同時(shí)證明了分子標(biāo)記技術(shù)在物種遺傳關(guān)系的分析具有重要作用。Essid等[14]利用13對SSR引物對20種突尼斯野生無花果進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明不同地理區(qū)域的無花果遺傳多樣性較窄。郭正兵等利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管分析法對30份無花果資源進(jìn)行了遺傳多樣性的鑒定，通過聚類分析在0.77處將其分成2大類，并且得出金傲芬與A 1213間的親緣關(guān)系較近，紫陶芬，青皮親緣關(guān)系密切，布蘭瑞克和瑪斯義陶芬親緣關(guān)系較近聚集在0.40以下[3]。結(jié)果表明，25種無花果種質(zhì)資源的遺傳距離在0.20～1.00之間，平均為0.60，布蘭瑞克和瑪斯義陶芬被聚為一類；A 1213和青皮被聚在一起，親緣關(guān)系較強(qiáng)。與郭正兵等[3]的聚類分析結(jié)果相似。而以色列和馬斯義陶芬遺傳距離最小為0.20，親緣關(guān)系最近。馬斯義陶芬原產(chǎn)美國加州，從日本引入我國，屬于紅色大果型無花果品種而以色列果實(shí)黃綠色，二者果實(shí)顏色、大小等形態(tài)學(xué)差異較大卻表現(xiàn)出非常近的親緣關(guān)系，這與郭正兵等[3]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果稍有不同?？傊?5種無花果中大多數(shù)品種遺傳距離為0.58以下，說明25種無花果種質(zhì)資源遺傳多樣性較窄，這可能是由于無花果長期采用無性繁殖的方式進(jìn)行，導(dǎo)致無花果種質(zhì)間的演化速度較低的緣故。本實(shí)驗(yàn)室同時(shí)進(jìn)行了25種無花果種質(zhì)資源的RAPD分析和ISSR分析。RAPD分析和ISSR分析將25種無花果種質(zhì)資源分成2大類，并且這2種分析結(jié)果相似都是把布蘭瑞克單獨(dú)聚為一類，聚類結(jié)果與本試驗(yàn)不太一致，可能是不同的分析方法稍有不同導(dǎo)致的結(jié)果。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)在對植物進(jìn)行植資源進(jìn)行鑒定方面也得到了廣泛應(yīng)用。王慶彪等[15]利用SSR分子標(biāo)記篩選獲得20對核心引物，用于構(gòu)建中國50個(gè)甘藍(lán)代表品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫，通過構(gòu)建人工模擬群體對‘中甘21’品種的真實(shí)性進(jìn)行鑒定，準(zhǔn)確率達(dá)100%。苑克俊等[16]利用6個(gè)熒光SSR分子標(biāo)記研究15份杏種質(zhì)，建立15份杏種質(zhì)的分子身份證，成功區(qū)分4個(gè)杏新品系，為4個(gè)杏新品系利用分子鑒定進(jìn)行品種權(quán)保護(hù)提供依據(jù)。前人已經(jīng)采用了RAPD，SSR等分子標(biāo)記技術(shù)對無花果進(jìn)行了鑒定，如王亮等[17]利用SSR和RAPD技術(shù)對11種無花果進(jìn)行了DNA分析，為品種鑒定提供了分子水平上的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用的是SSR技術(shù)對無花果進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定。20種引物對不同地區(qū)的25個(gè)無花果品種進(jìn)行SSR分析，結(jié)果表明SSR可以作為一種分子標(biāo)記來進(jìn)行品種的鑒定，如：MFC 1 F/1 R引物對可鑒定出19號；LMFC 38 F/38 R引物對可鑒定出23號。無花果SSR分子標(biāo)記的建立為構(gòu)建無花果DNA指紋圖譜進(jìn)行分子水平的鑒定奠定了基礎(chǔ)。