一起蛋雞雞白痢病例的病原分離與鑒定

吳旭錦，朱小甫，楊 萍，高 睿，張文娟，熊忙利，邢 蕾

(1.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.咸陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 咸陽(yáng) 712000；3.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

雞白痢(pullorum disease)是雞群常見(jiàn)的一種重要細(xì)菌性傳染病，感染范圍廣，經(jīng)濟(jì)損失大，一直是種雞凈化的重點(diǎn)傳染病。其病原為雞白痢沙門(mén)氏菌(Salmonella pullorum)，該菌為腸桿菌科、沙門(mén)氏菌屬成員[1]。臨床上雞白痢沙門(mén)氏菌主要侵害2～3周齡雛雞，引起雞群腹瀉，拉白色石灰水樣稀糞，或引起敗血癥，死亡率較高。成年雞主要表現(xiàn)為隱性感染，導(dǎo)致產(chǎn)蛋率和受精率下降，雞苗質(zhì)量不高，經(jīng)濟(jì)損失較大[2,3]。該病既能水平傳播又能垂直傳播，是沙門(mén)氏菌病防控的難點(diǎn)之一?？股卦谏抽T(mén)氏菌病的防控中起了重要作用，但長(zhǎng)期以來(lái)由于養(yǎng)殖過(guò)程中普遍存在濫用、長(zhǎng)時(shí)間用抗生素現(xiàn)象，導(dǎo)致耐藥性沙門(mén)氏菌越來(lái)越多，抗生素治療效果不佳，給臨床治療帶來(lái)了很大的困擾[4～6]。筆者從渭南市某育成雞場(chǎng)發(fā)病雞樣本中分離和鑒定了一株耐藥性雞白痢沙門(mén)氏菌，為該病的進(jìn)一步防治提供了思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 2018年12月，陜西渭南某2萬(wàn)規(guī)模的育成雞場(chǎng)，雞群16日齡出現(xiàn)發(fā)病情況，發(fā)病雛雞精神不振，縮頸閉眼，食欲減退，絨毛蓬松，翅膀下垂，擁擠打堆，病雞排白色漿糊狀糞便，肛門(mén)周圍絨毛被糞便污染，病雛叫聲尖銳，發(fā)病率約60%，病死率約90%。剖檢死亡雛雞，發(fā)現(xiàn)肺臟充血出血，心肌有少量白色結(jié)節(jié)，肝臟有灰白色壞死灶，膽囊充盈，盲腸腫脹，漿膜有白色結(jié)節(jié)，腎臟輸尿管充滿尿酸鹽呈花斑樣外觀。雞場(chǎng)先后用慶大霉素、阿莫西林、阿米卡星和復(fù)方磺胺氯噠嗪鈉等藥物治療，但沒(méi)有任何效果。無(wú)菌采集肝臟和脾臟，備用。

1.1.2 試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯為動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室自制；麥康凱瓊脂、SS瓊脂與營(yíng)養(yǎng)瓊脂為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；藥敏紙片與微生物鑒定管，杭州濱河微生物試劑有限公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。DNAiso、RNAiso核酸提取試劑、rTaq酶、dNTP等分子生物學(xué)試劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康小白鼠20只，體重35 g左右，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)雞白痢沙門(mén)氏菌invA基因(EU348368)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性檢測(cè)引物，上游引物invA-F序列為ATCATTTCTATGTTCGTCATTC，下游引物invA-R序列為GCGGGAATCCCGGCAGAGTT，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為826bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 用肝臟平整的切面制作觸片，干燥后用革蘭氏染液進(jìn)行染色，顯微鏡油鏡觀察[7]。無(wú)菌法取組織樣品，劃線法接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和SS平板，37℃有氧條件培養(yǎng)12 h，待形成形態(tài)典型的菌落時(shí)挑菌接種于普通肉湯，于37℃、200 r·min-1條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)12 h。將肉湯培養(yǎng)物再次瓊脂平板劃線，培養(yǎng)后選擇形態(tài)特征明顯的菌落，染色鏡檢觀察，視野中為形態(tài)單一的細(xì)菌時(shí)，挑取該菌落菌種接種于肉湯搖動(dòng)培養(yǎng)，獲得的肉湯即為細(xì)菌純培養(yǎng)物。

1.2.2 生化試驗(yàn) 在生物安全柜中將待檢菌純培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖與甘露醇微量發(fā)酵管，置于恒溫箱37℃培養(yǎng)，12 h后觀察結(jié)果。用接種針蘸取菌液，在硫酸亞鐵培養(yǎng)基中穿刺接種，恒溫箱37℃培養(yǎng)96 h，觀察穿刺線周圍是否變黑[8]。接種待檢菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后進(jìn)行M.R試驗(yàn)，觀察結(jié)果。將待檢菌接種于鄧亨氏蛋白胨水，培養(yǎng)3 d后進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)[9]。

1.2.3 雞沙門(mén)氏菌PCR鑒定 根據(jù)DNAiso試劑說(shuō)明提取純化菌DNA。PCR反應(yīng)體系組成為DNA模板 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，invA-F、invA-R各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5μL，超純水補(bǔ)足至25.0 μL。PCR條件：95 ℃ 5 min進(jìn)行預(yù)變性，進(jìn)入循環(huán)后94 ℃ 40 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 50s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，PCR結(jié)束后進(jìn)行電泳觀察。送PCR產(chǎn)物到生工生物工程(上海)有限公司西安測(cè)序部進(jìn)行序列測(cè)定，并比對(duì)分析序列結(jié)果。

1.2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取健康小鼠20只，隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組和對(duì)照組各10只，試驗(yàn)組小鼠每只腹腔注射0.2 mL細(xì)菌肉湯，對(duì)照組小鼠每只腹腔注射0.2 mL生理鹽水，每日觀察發(fā)病情況。

1.2.5 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板均勻涂布菌液，待菌液吸收無(wú)可流動(dòng)液體時(shí)將藥敏紙片均勻貼在瓊脂表面，37℃培12h后觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌環(huán)直徑。

1.2.6 常見(jiàn)禽病毒性疾病RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)RNAiso試劑說(shuō)明書(shū)提取組織病料中的總RNA，采用本實(shí)驗(yàn)室所建立的雞群病原RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒進(jìn)行排查[10,11]。

1.2.7 雞場(chǎng)水質(zhì)檢測(cè) 水樣為雞場(chǎng)送檢的窖藏水，按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY5027-2008進(jìn)行。將水樣作5倍系列稀釋，選用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)。另外將水樣接種于SS瓊脂平板，37℃培12 h后觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與染色結(jié)果

用采集的肝臟組織制作觸片，革蘭氏染色鏡檢，鏡下可見(jiàn)密集的革蘭氏陰性小桿菌。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板和SS平板上均有細(xì)菌生長(zhǎng)，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱平板上均形成直徑1～3 mm左右大小的灰白色半透明樣菌落，在SS平板上形成直徑1～3 mm左右大小的頂端黑色菌落。挑取典型黑色菌落，染色鏡檢可見(jiàn)形態(tài)一致的革蘭氏陰性中等大小的桿菌(圖1)。

圖1 細(xì)菌分離與染色鏡檢結(jié)果

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能發(fā)酵鼠李糖、甘露醇和甘露糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵乳糖和蔗糖，檸檬酸鹽利用、MR、H2S試驗(yàn)呈陽(yáng)性，VP、靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陰性(表1)。試驗(yàn)結(jié)果符合雞白痢沙門(mén)氏菌的生化特征。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性，“⊕”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

2.3 分離菌PCR鑒定與分析

通過(guò)設(shè)計(jì)的雞白痢沙門(mén)氏菌保守基因invA 檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳發(fā)現(xiàn)成功獲得了826bp的目的條帶(圖2)。PCR產(chǎn)物測(cè)序后用DNAstar軟件進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)分離菌invA基因序列與參考菌EU348368、NC003197同源性為99%～100%，提示分離菌確為一株雞白痢沙門(mén)氏菌。

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

接種肉湯的試驗(yàn)組小鼠12 h內(nèi)全部死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)死亡小鼠主要表現(xiàn)為腸炎，腸粘膜充血、出血，腸系膜淋巴結(jié)潮紅腫大，被膜緊張，肝臟有針尖大灰白色壞死點(diǎn)，而對(duì)照組采食飲水正常，表現(xiàn)健康。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果提示分離菌致病性強(qiáng)。

圖2 分離菌PCR檢測(cè)結(jié)果

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，35種抗生素中，僅有米諾環(huán)素有抑菌環(huán)，且為中度敏感，其他34種抗生素均無(wú)抑菌環(huán)，結(jié)果表明分離到一株耐藥性極強(qiáng)的細(xì)菌(表2)。

表2 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

注：R為耐藥，I為中敏，S為高敏。

2.6 病毒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)，禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒核酸均為陰性，提示雞群發(fā)病與這4種病毒感染無(wú)關(guān)。

2.7 水質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

在5倍稀釋的水樣中，細(xì)菌分布符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，送檢水樣細(xì)菌總數(shù)為1 005個(gè)·mL-1。而標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定畜禽飲用水總菌群成年家畜不超過(guò)100個(gè)·mL-1，幼齡家畜不超過(guò)10個(gè)·mL-1。送檢水細(xì)菌總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)。為確定水中細(xì)菌種類，將水樣接種在SS平板上，結(jié)果在SS平板上生長(zhǎng)出密布的頂端黑色中等大小菌落，染色鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)菌為革蘭氏陰性中等大小桿菌，符合沙門(mén)氏菌特征。

3 討論

隨著我國(guó)蛋雞養(yǎng)殖水平的不斷提高，雞場(chǎng)一般比較重視沙門(mén)氏菌的凈化工作，雞白痢在規(guī)模雞場(chǎng)很少發(fā)生。但在本病例中，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，排除了危害性大的4種病毒性傳染病，即禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒感染。在細(xì)菌分離時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，病死仔雞肝臟中存在大量單一革蘭氏陰性桿菌，不存在其他細(xì)菌感染現(xiàn)象。細(xì)菌分離鑒定發(fā)現(xiàn)分離菌符合雞白痢沙門(mén)氏菌的生化特征，通過(guò)PCR檢測(cè)與invA基因測(cè)序分析證實(shí)分離菌確為雞白痢沙門(mén)氏菌，動(dòng)物回歸試驗(yàn)表明分離菌致病性很強(qiáng)，確定了雞白痢沙門(mén)氏菌是本次發(fā)病的病原。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥敏試劑盒35種抗生素中，僅有米諾環(huán)素1種抗生素中度敏感，其他34種均嚴(yán)重耐藥，無(wú)任何抑菌環(huán)，細(xì)菌耐藥性極強(qiáng)，十分罕見(jiàn)，這也是雞場(chǎng)多次更換抗生素仍然效果不佳的主要原因，這一結(jié)果和國(guó)內(nèi)其他地區(qū)分離菌存在相似之處，即沙門(mén)氏菌耐藥性日益嚴(yán)峻，且以多重耐藥為特點(diǎn)[1～3]。為闡明感染來(lái)源，通過(guò)對(duì)送檢水樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雞群飲用的窖藏水細(xì)菌嚴(yán)重超標(biāo)，為標(biāo)準(zhǔn)的10倍左右。分離細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，水中主要存在沙門(mén)氏菌污染，提示雞群發(fā)病和水質(zhì)不潔密切相關(guān)，雞群飲用水被沙門(mén)氏菌嚴(yán)重污染是雞群發(fā)病的根本原因。明晰病因后，通過(guò)嚴(yán)格的飲水消毒和使用敏感藥物，雞群死亡得到了控制，隨后建議雞場(chǎng)棄用窖藏水，改用自來(lái)水，定期檢測(cè)水質(zhì)和消毒。在養(yǎng)殖過(guò)程中嚴(yán)格控制抗生素的使用，必須使用時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，避免盲目用藥，減少經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。