急性壞死性胰腺炎大鼠腹腔巨噬細胞胱天蛋白酶募集域蛋白9、Toll樣受體4的作用機制

何陽寰 徐萍 楊志文 田軍

南京醫(yī)科大學附屬上海松江中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 201600

【提要】 提取急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)，通過攜帶靶向胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)的腺病毒感染巨噬細胞后，細胞TLR4、CARD9、NF-κB、p38MAPK基因表達均下降(P值均<0.05)，多聚肌苷酸鹽P4154干預可上調(diào)TLR4基因表達，進而上調(diào)CARD9、NF-κB、p38 MAPK基因的表達(P值均<0.05)，提示ANP大鼠腹腔巨噬細胞存在TLR4/CARD9/NF-κB(p38MAPK)信號途徑。

急性胰腺炎(AP)是一種炎癥性疾病，盡管嚴重程度各不相同，但腺泡損傷都與胰腺早期炎癥反應相關，其特征是巨噬細胞激活，分泌多種細胞因子[1]。選擇性清除腹腔巨噬細胞可減少早期細胞因子的來源，降低細胞因子的級聯(lián)放大效應，將炎癥反應控制在胰腺局部，減輕全身的炎癥反應，從而改善患者預后[2]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9)是在樹突細胞和先天骨髓細胞的巨噬細胞內(nèi)高度表達的一種免疫炎癥蛋白[3]，可激活NF-κB、p38MAPK等炎癥反應信號通路，參與多種感染性炎癥反應[4]。本課題組前期研究結果顯示，重癥AP(SAP)患者外周血單核細胞CARD9的表達升高，且與NF-κB、p38MAPK蛋白磷酸化水平呈正相關[5-7]，通過攜帶靶向CARD9的siRNA腺病毒(siR-CARD9)感染可阻斷NF-κB和p38MAPK的激活，減輕胰腺組織的炎癥反應[8]。本研究通過siR-CARD9感染腹水巨噬細胞，探討CARD9基因?qū)毙詨乃佬砸认傺?ANP)大鼠腹水巨噬細胞的作用機制。

一、材料與方法

1．腹水巨噬細胞的分離、純化及分組：60只健康雄性Sprague Dawley大鼠，鼠齡2～2.5個月，SPF級， 體重240～260 g， 由上海捷思杰實驗動物公司提供和飼養(yǎng)，動物合格證號SCXK(滬)2013-0006。采用膽胰管逆行注射50 g/L?；悄懰徕c1 ml/kg體重方法制備大鼠ANP模型[9]，共48只。其余12只正常喂養(yǎng)，作為對照組。造模后3、6 h在無菌環(huán)境下抽取腹水，并以25 ml預冷PBS行腹腔灌洗2次，對照組直接行腹腔灌洗。將腹腔灌洗液及腹水混合均勻，以密度梯度離心法分離腹水巨噬細胞，以DMEM完全培養(yǎng)液(含10% FBS)吹打混勻沉淀細胞，均勻種植于12孔培養(yǎng)板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

將巨噬細胞分為對照組(6只大鼠的純化量)，ANP 3、6 h組(各6只量)，ANP 3 h+siR-CARD9、ANP 6 h+siR-CARD9組(各6只量)，ANP 3 h+腺病毒、ANP 6 h+腺病毒組(各6只量)，多聚肌苷酸鹽P4154對照組(Poly組，6只量 )，ANP 3h+Poly組和ANP 3h+siR-CARD9+Poly組(各6只量)。siR-CARD9腺病毒委托和元生物技術(上海)有限公司構建、鑒定，病毒原液為1×1011/ml。巨噬細胞培養(yǎng)6 h后按MOI為1∶200(通過預實驗獲得的最佳MOI)的病毒量置無血清培養(yǎng)液中感染巨噬細胞3 h，棄上清，換成含5%血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h[10]，倒置熒光顯微鏡下(400倍)隨機選取6個視野(至少100個細胞)進行細胞計數(shù)。

多聚肌苷酸鹽P4154購自美國SIGMA公司。巨噬細胞培養(yǎng)6 h后加入含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h，棄上清，加入終濃度為20 μg/ml的多聚肌苷酸再繼續(xù)培養(yǎng)24 h[11]，倒置熒光顯微鏡下(400倍)隨機選取6個視野(至少100個細胞)進行細胞計數(shù)。

2．腹水巨噬細胞CARD9、NF-κB、Toll樣受體4(TLR4)mRNA表達檢測：用Trizol(美國Invitrogen公司)提取腹腔巨噬細胞總RNA，用逆轉錄試劑盒(日本Takara公司)將總RNA反轉錄成cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測CARD9、NF-κB、TLR4 mRNA表達，以GAPDH作為內(nèi)參。CARD9 上游引物5′-ATTGACCCCTCACGAATCAC-3′，下游引物5′-AGGAGCACACCCACTTTCC-3′；NF-κB上游引物5′-CCTGTCTGAAGCCCTGCTAC-3′，下游引物5′-TGCCAGGTCTGTGAACACTC-3′；p38上游引物5′-ATGACGAAATGACCGGCTAC-3′，下游引物5′-CCACGGACCAAATATCCACT-3′； 內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 45 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCT計算目的基因mRNA的相對表達量。

3．腹腔巨噬細胞CARD9、p65、p-p65、p38、p-p38MAPK、TLR4蛋白表達檢測：應用蛋白裂解液提取腹腔巨噬細胞，蛋白定量后采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測腹腔巨噬細胞CARD9、p65、p-p65、p38、p-p38MAPK、TLR4蛋白表達量。

4．細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測：取各組大鼠腹水巨噬細胞培養(yǎng)上清，采用ELASA法檢測上清液TNF-α、IL-1β、IL-6水平。試劑盒購自美國eBioScience公司，按說明書操作。

二、結果

1．各組大鼠腹腔巨噬細胞CARD9 mRNA及蛋白表達變化：ANP大鼠腹腔巨噬細胞CARD9 mRNA及蛋白表達量隨時間延長而升高，與對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(t3h=10.20、t6h=6.93；t3h=-7.17、t6h=-6.56，P值均<0.05)。siR-CARD9腺病毒感染后ANP大鼠腹腔巨噬細胞CARD9 mRNA表達量較ANP組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(t3h=-7.17、t6h=-6.56；t3h=-14.68、t6h=-11.44，P值均<0.05)，而空載腺病毒感染后巨噬細胞CARD9 mRNA及蛋白表達量與ANP組的差異無統(tǒng)計學意義。多聚肌苷酸鹽P4154干預后巨噬細胞CARD9 mRNA及蛋白表達量較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.79、14.55，P值均<0.01)，但與ANP組差異無統(tǒng)計學意義；若siR-CARD9腺病毒加P4154共同干預ANP大鼠腹腔巨噬細胞，則CARD9 mRNA 及蛋白表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(t=-9.22、-6.92，P值均<0.05，表1)。

組別只數(shù)CARD9 mRNACARD 9蛋白對照組61.00±0.011.00±0.01ANP 3 h組616.57±3.74a4.31±0.38bANP 6 h組633.63±11.54b9.65±1.14aANP 3 h+siR-CARD9組63.48±2.46d1.38±0.11dANP 6 h+siR-CARD9組62.28±1.98c1.74±0.77dANP 3 h+腺病毒組624.35±19.01b4.34±2.35bANP 6 h+腺病毒組627.89±24.40b8.50±2.37bPoly組68.07±1.97b77.66±5.79bANP 3 h+Poly組610.20±2.31b76.82±4.79bANP 3 h+Poly+siR-CARD9組61.42±0.29d37.98±5.14d

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與ANP組比較，cP<0.05，dP<0.01

2．各組巨噬細胞TLR4、NF-κB、p38MAPK mRNA及蛋白表達的變化：ANP大鼠腹腔巨噬細胞TLR4、NF-κB、p38MAPK mRNA及蛋白表達量隨時間延長而升高，與對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(tNF-κBmRNA=7.64、6.15，tp38MAPKmRNA=9.50、3.24，tTLR4 mRNA=6.29、6.23，P值均<0.05；tTLR4protein=3.61、19.02，tNF-κBprotein=14.21、12.36，tp38MAPKprotein=42.65、84.03，P值均<0.05)。siR-CARD9腺病毒感染后ANP大鼠腹腔巨噬細胞CARD9 mRNA表達量較ANP組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(t3h=-7.17、t6h=-6.56，P<0.05)，而空載腺病毒感染后巨噬細胞CARD9 mRNA及蛋白表達量與ANP組的差異無統(tǒng)計學意義。多聚肌苷酸鹽P4154干預后巨噬細胞CARD9 mRNA 及蛋白表達量較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.79、16.26，P值均<0.01)，但與ANP組的差異無統(tǒng)計學意義；若siR-CARD9腺病毒加P4154共同干預ANP大鼠腹腔巨噬細胞，則CARD9 mRNA及蛋白表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(t=-9.22、-9.57，P值均<0.01，表2)。

3．各組大鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平的變化：ANP組腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(tTNF-α=8.67、8.25，tIL-β=3.96、8.92，tIL-6=3.90、13.29，P值均<0.05)。siR-CARD9腺病毒感染后ANP大鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較ANP組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(tTNF-α=-4.59、-5.17，tIL-β=-5.33、-6.80，tIL-6=-7.35、-8.95，P值均<0.05)，而空載腺病毒感染后巨噬細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平與ANP組的差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

表2 各組巨噬細胞TLR4、NF-κB、p38MAPK mRNA及蛋白表達的變化

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與ANP組比較，cP<0.05，dP<0.01

表3 各組巨噬細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與ANP組比較，cP<0.05，dP<0.01

討論巨噬細胞激活是SAP過程中的早期事件，受傷的胰腺作為炎癥刺激物激活巨噬細胞和其他炎癥細胞釋放TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、PAF、NO等細胞因子，細胞因子又通過級聯(lián)反應放大產(chǎn)生協(xié)同效應，最終導致病情加重[12]。

CARD9是適配子分子，其含有對蛋白質(zhì)寡聚化重要的N-端半胱天冬酶-募集結構域(CARD)和C-末端卷曲螺旋結構域。 CARD9位于染色體9q34.3上，其cDNA 2 108 bp長編碼536個氨基酸的蛋白質(zhì)，預測分子量為62 3000[13]，它能在巨噬細胞內(nèi)與Bc110、Maltl結合，形成CARD9/Bcl10/Maltl復合體(CBM復合體)，進而激活NF-κB、p38MAPK信號通路[14-16]。

Toll樣受體(TLRs)介導環(huán)境刺激和先天免疫之間的相互作用。TLR4不僅在免疫細胞中表達，而且在胰腺導管、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞中表達。牛黃膽酸鹽引起的胰腺腺泡細胞壞死、水腫和出血在TLR4-/-小鼠中顯著降低[17]。TLR4在炎癥疾病中可通過絲氨酸-蘇氨酸激酶激活CARD9-Bcl-10-MALT1復合體從而激活NF-κB、p38MAPK通路，進而調(diào)控下游炎性因子的表達[18]，也可以不通過CARD9復合體激活NF-κB通路。

本課題組前期研究[19]結果顯示，SAP患者外周血單核細胞的NF-κB、p38MAPK信號通路被激活。本研究結果顯示，ANP大鼠腹腔巨噬細胞CARD9 mRNA表達隨時間增加而逐漸升高，同時TLR4、NF-κB、p38MAPK mRNA及蛋白的表達上調(diào)，外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子水平顯著升高。應用攜帶靶向CARD9的腺病毒感染后，腹腔巨噬細胞的CARD9表達被抑制，同時TLR4 mRNA及蛋白表達下調(diào)，NF-κB、p38MAPK NF-κB、p38MAPK磷酸化水平下降 ，細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平下降，提示CARD9基因能激活NF-κB和p38MAPK信號通路，釋放大量促炎細胞因子，使局部炎癥反應向全身擴散。

本研究結果還顯示，應用多聚肌苷酸干預后，腹腔巨噬細胞TLR4及CARD9基因表達上調(diào)，同時細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達升高。加上攜帶靶向CARD9腺病毒感染后腹腔巨噬細胞CARD9、TLR4基因表達下調(diào)，培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β和IL-6 水平明顯降低，進一步提示TLR4是CARD9信號通路中的上游信號分子。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突