毛蕊異黃酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用及機(jī)制研究*

曾文鄲 苗慧 任倩瑤△

(1. 桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；2. 桂林醫(yī)學(xué)院廣西腫瘤免疫與微環(huán)境腫瘤實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004)

乳腺癌作為嚴(yán)重威脅世界女性健康的殺手之一，占女性所患惡性腫瘤的13.7%，且發(fā)病率逐年攀升[1]。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)乳腺癌的診治工作取得了顯著進(jìn)展，但耐藥現(xiàn)象明顯，易導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[2]。因此，尋求安全有效的新型藥物，改善乳腺癌微環(huán)境，提高治療效果，是當(dāng)今乳腺癌研究的熱點(diǎn)，因此是從植物、水果和蔬菜中提取出來的非甾體類化合物，分為黃豆素類、木酚素類和異黃酮類三種，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素極為相似[3]，因此具有雌激素樣作用，可用于治療激素類疾病，如心血管疾病、卵巢癌、乳腺癌[4]等。研究表明，毛蕊異黃酮作為一種從中藥黃芪中分離出來的異黃酮類植物雌激素，具有多種潛在的藥理活性。本課題組一直致力于毛蕊異黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞的研究工作，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮能夠抑制ER(-)乳腺癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡[5]，但是對(duì)ER(+)乳腺癌細(xì)胞的研究甚少。本研究擬探討毛蕊異黃酮對(duì)ER(+)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響及其可能的信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制，為臨床乳腺癌的治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T47D購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；毛蕊異黃酮(純度>98%)購自成都普瑞法有限公司，濃度梯度分別為0、25、50、100 μM溶于DMSO，4℃保存；DMEM培養(yǎng)基、10%FBS胎牛血清、青鏈霉素、胰酶購自Gibco公司；CCK8試劑購自Sigma公司；Hoechst 33258凋亡染色試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V/FITC流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；4%多聚甲醛溶液、30%丙烯酰胺、Glycine、APS、SDS購自北京索萊寶科技有限公司；ERK1/2、p-ERK1/2一抗購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

ER陽性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T47D均為本實(shí)驗(yàn)室保存，均用含有10%FBS胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，CO2含量為5%。

1.2.2CCK8生長曲線

分別取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，接種體積為100 μL·孔-1，接種密度為3×105·孔-1。細(xì)胞貼壁之后，更換含有不同濃度毛蕊異黃酮(0、25、50、100 μM)的培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間后(0、24、48、72 h)，每孔加入CCK8試劑10 μL溶液，靜置4 h，溫度37 ℃，孵育1 h后，在450 nm波長下用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Hoechst 33258熒光染色法

分別取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于6孔板中，接種體積為2 mL·孔-1，接種密度為5×105·孔-1。細(xì)胞貼壁之后，更換含有不同濃度毛蕊異黃酮(0、50、100 μM)的培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定液0.5 mL，10 min后去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，避光染色5 min后，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗2次，每次3 min。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)，記錄細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)

分別取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于6孔板中，接種體積為2 mL·孔-1，接種密度為5×105·孔-1。細(xì)胞貼壁之后，更換含有不同濃度毛蕊異黃酮(0、50、100 μM)的培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106·mL-1，制成單細(xì)胞懸液，加入100 μL Binding Buffer和10μL FITC標(biāo)記的Annexin-V，室溫避光30 min，再加入5 μL PI，避光5 min后，加入400 μL Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Western blotting法

分別取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于6孔板中，接種體積為2 mL·孔-1，接種密度為5×105·孔-1。細(xì)胞貼壁之后，更換含有不同濃度毛蕊異黃酮(0、50、100 μM)的培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，用蛋白提取試劑盒按操作說明提取細(xì)胞總蛋白，紫外線分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度后煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)4h至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別孵育ERK1/2、p-ERK1/2一抗單克隆抗體(1：1000)，4 ℃過夜，TBST洗膜三次，加入二抗(1：5000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL plus發(fā)光劑，顯色，暗室曝光，計(jì)算機(jī)定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 毛蕊異黃酮對(duì)MCF-7、T47D細(xì)胞增殖的影響

25、50、100 μM毛蕊異黃酮處理MCF-7、T47D細(xì)胞，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖過程均受到毛蕊異黃酮的抑制，并呈劑量和時(shí)間依賴性(P<0.05)。同時(shí)，經(jīng)100 μM毛蕊異黃酮濃度處理72 h后，MCF-7、T47D細(xì)胞增殖的抑制效果最為明顯(P<0.05)，見圖1。

圖1 CCK8檢測(cè)不同濃度毛蕊異黃酮對(duì)MCF-7、T47D細(xì)胞增殖的影響

2.2 毛蕊異黃酮對(duì)MCF-7、T47D細(xì)胞凋亡的影響

50、100 μM毛蕊異黃酮作用MCF-7、T47D細(xì)胞48 h后，Hoechst 33258熒光染色顯示，隨著毛蕊異黃酮藥物濃度升高，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)核固縮，并且核碎裂與凋亡小體明顯增加，呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖2。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，MCF-7、T47D細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率隨藥物濃度升高而增高，100 μM毛蕊異黃酮對(duì)細(xì)胞促凋亡效應(yīng)更為顯著(P<0.05)，見圖3。

圖2 Hoechst染色測(cè)定不同濃度毛蕊異黃酮對(duì)MCF-7、T47D細(xì)胞凋亡的影響(×400)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度毛蕊異黃酮對(duì)MCF-7、T47D細(xì)胞凋亡的影響

2.3 毛蕊異黃酮對(duì)ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響

50、100 μM毛蕊異黃酮作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞48h后，Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，50、100 μM毛蕊異黃酮藥物組中的p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)比值明顯降低，并且這種抑制水平隨著毛蕊異黃酮濃度的升高而增加，表明其具有劑量依賴性(P<0.05)，見圖4。

圖4 Western blottin檢測(cè)不同濃度毛蕊異黃酮對(duì)ERK1/2蛋白磷酸化表達(dá)水平的影響注：A-MCF-7乳腺癌細(xì)胞中p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量；B-蛋白質(zhì)灰度值掃描統(tǒng)計(jì)；p-ERK1/2與ERK1/2蛋白表達(dá)相比，* P<0.05。

3 討論

植物雌激素與哺乳動(dòng)物體內(nèi)雌激素，無論在化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性方面都十分相似，能夠發(fā)揮類雌激素和抗雌激素雙向調(diào)節(jié)作用[6]。據(jù)研究表明，多種植物雌激素可以通過調(diào)節(jié)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的遷移侵襲能力[7,8]。毛蕊異黃酮是一種典型的植物雌激素，可以通過結(jié)合雌激素受體調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤、抗炎等多種功效[9]。值得注意的是，我們之前的研究已經(jīng)證明植物雌激素毛蕊異黃酮成功地抑制了ER(-)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。但毛蕊異黃酮是否對(duì)ER(+)乳腺癌細(xì)胞具有相同的誘導(dǎo)作用，其涉及的具體機(jī)制如何，這些都有待進(jìn)一步地研究。

基于此原因，本研究中毛蕊異黃酮明顯抑制ER陽性人乳腺癌MCF-7、T47D細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間和劑量依賴性，具體表現(xiàn)為隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞的增殖抑制率增高。同時(shí)，經(jīng)毛蕊異黃酮處理后的乳腺癌MCF-7、T47D細(xì)胞，從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)層面均出現(xiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)目增多，凋亡率增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。特別是在藥物濃度為100 μM毛蕊異黃酮時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率效果顯著。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)是MAPK家族中的主要成員，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑，其激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)已被廣泛研究。ERK1/2磷酸化后即p-ERK1/2，能夠?qū)⒍喾N細(xì)胞外信號(hào)通過磷酸化活化逐級(jí)傳遞至細(xì)胞核，作用于細(xì)胞內(nèi)的生長因子、細(xì)胞因子、腫瘤啟動(dòng)因子，例如Elk-1、c-myc、c-fos、c-jun、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白激酶底物[10]。ERK1/2的激活能夠參與調(diào)控有絲分裂、減數(shù)分裂等功能，與細(xì)胞生長、增殖、分化、遷移和存活密切相關(guān)[11]。在乳腺癌與MAPK信號(hào)通路關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，p-ERK1/2蛋白高表達(dá)存在于乳腺癌中；而當(dāng)MAPK通路被抑制時(shí)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)則下降[12]。我們的研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果相吻合，當(dāng)不同濃度毛蕊異黃酮處理乳腺癌MCF-7、T47D細(xì)胞后，p-ERK1/2 / ERK1/2比值下降，并呈劑量依賴性，提示毛蕊異黃酮可以降低ERK1/2磷酸化蛋白水平，從而抑制MAPK通路的活性。

綜上所述，毛蕊異黃酮能夠抑制乳腺癌MCF-7、T47D細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用，其機(jī)制可能是通過抑制MAPK通路的激活而實(shí)現(xiàn)的。毛蕊異黃酮在乳腺癌的治療中存在廣泛的應(yīng)用前景，本研究為毛蕊異黃酮作為抗乳腺癌藥物提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。