珠子參總皂苷對(duì)心肌缺血再灌注大鼠血清MCP-1、MIF和TNF-α的影響

張 磊，許 強(qiáng)，李盈盈，劉宏軍

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指心肌缺血一定時(shí)間后，再次恢復(fù)心肌血供反而會(huì)加重心肌損傷。急性心肌梗死病人在接受最佳的再灌注治療后，仍有10%～30%會(huì)發(fā)生MIRI，MIRI被認(rèn)為是導(dǎo)致心肌梗死后心力衰竭、死亡的主要原因[1]，因此，如何防治MIRI顯得尤為重要。有研究表明，炎癥因子水平的高低與缺血后心臟功能損害程度和心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量直接相關(guān)，提示炎癥反應(yīng)在MIRI中起著重要作用[2-3]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是一種趨化因子，在心肌MIRI時(shí)表達(dá)增加，可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，并與巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等共同參與炎癥的發(fā)生發(fā)展，在MIRI中發(fā)揮著重要作用[4]。在關(guān)于如何減輕MIRI程度的研究中，采用中藥有效成分提取物或中藥復(fù)方進(jìn)行預(yù)處理，顯示出一定的優(yōu)勢(shì)[3]。珠子參是五加科人參屬植物珠子參的干燥根狀莖，具有補(bǔ)肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛、止血之功，珠子參總皂苷是其主要活血成分之一[5]。有研究表明，珠子參總皂苷對(duì)心腦血管疾病有著廣泛的藥理作用[5]。本研究旨在探討珠子參總皂苷對(duì)大鼠MIRI保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量252～306 g，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(鄂)2011-0012]。參照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，室溫(22±2)℃，濕度(60±5)%，12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。

1.2 藥物與試劑 珠子參總皂苷，由三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，純度為96.5%；MCP-1(南京建成科技有限公司)；MIF(南京建成科技有限公司)；大鼠TNF-α(南京建成科技有限公司)；20%氨基甲酸乙酯溶液(湖北信康醫(yī)藥化工有限公司)。

1.3 主要儀器 電子天平(上海天平儀器廠)；LDZ5-2 型自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)； ALC-V8 型動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾特生物科技有限公司)；16導(dǎo)生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)(美國(guó) Biopac 公司)。

1.4 分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為5組：假手術(shù)組、模型組和珠子參總皂苷低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)、高劑量組(200 mg/kg)。珠子參總皂苷組灌胃給予相應(yīng)的藥物，灌胃體積為20 mL/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥1周，假手術(shù)組和模型組給予同體積的生理鹽水。

1.5 模型建立 大鼠MIRI模型的制備參考文獻(xiàn)[6]，具體如下：術(shù)前禁食12 h，末次給藥30 min后，采用20%氨基甲酸乙酯溶液(1.5 g/kg)行腹腔麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。經(jīng)口腔行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸頻率80次/min，潮氣量5～6 mL，呼吸比1∶2。針形電極插入四肢皮下，連接心電圖機(jī)，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。在胸骨左側(cè)第4肋間，沿肋間隙方向剪開(kāi)1 cm左右的切口，鈍性分離肌肉組織，用彎頭鉗打開(kāi)胸腔，擠壓心臟，使其充分暴露。在左心耳和肺動(dòng)脈圓錐間找到與左冠狀動(dòng)脈伴行的冠狀靜脈，在左心耳下方2 mm處以6/0無(wú)損傷縫合針穿線，進(jìn)針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm。結(jié)扎前，于冠狀靜脈處放置棉線，連同棉線(1.5～2.0 mm)一起結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，造成心肌缺血。30 min后再次開(kāi)胸，剪斷結(jié)扎線，使其再灌注120 min。假手術(shù)組只在相應(yīng)部位穿線不結(jié)扎。模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后其遠(yuǎn)端心肌顏色變灰白，Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段明顯抬高，表示心肌缺血復(fù)制成功；剪斷結(jié)扎線后，心肌顏色由灰白逐漸恢復(fù)正常，抬高的ST段下降1/2以上為再灌注復(fù)制成功。

1.6 標(biāo)本采集與監(jiān)測(cè) 再灌注結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血5 mL，靜置30 min后以3 000 r/min離心15 min，取血清，采用ELISA方法測(cè)定各組大鼠血清MCP-1、MIF和TNF-α。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠在體MIRI模型評(píng)估 本研究共擬建立大鼠在體MIRI模型40只。在實(shí)際操作過(guò)程中，僅珠子參總皂苷中劑量組1只大鼠發(fā)生氣胸死亡，其余大鼠全部建模成功。

2.2 珠子參總皂苷對(duì)MIRI大鼠血清MCP-1、MIF和TNF-α的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清 MCP-1、MIF、TNF-α水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； 與模型組比較，珠子參總皂苷高、中、低劑量組血清MCP-1、MIF、TNF-α水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α水平比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05

3 討 論

目前關(guān)于MIRI的機(jī)制研究有很多，炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是MIRI的主要機(jī)制之一[7]。MIRI是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，炎癥在其中扮演著重要角色。研究表明，炎癥細(xì)胞在再灌注早期即可侵入心肌組織，損傷心肌局部釋放大量的蛋白水解酶及促炎癥因子，進(jìn)而誘導(dǎo)和加重心肌損傷[8-9]。

MCP-1是趨化因子家族成員之一，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，能夠趨化、激活單核-巨噬細(xì)胞遷移并聚集在血管內(nèi)膜下，最終能夠活化為巨噬細(xì)胞，吞噬類(lèi)脂質(zhì)，形成富含膽固醇酯的泡沫細(xì)胞，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生[10]。MCP-1與冠心病關(guān)系密切，甚至可將其作為預(yù)測(cè)急性冠脈綜合征(ACS)的一個(gè)指標(biāo)[11]。心肌缺血再灌注時(shí)，MCP-1表達(dá)增加，趨化和激活單核-巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞,引起一系列炎癥反應(yīng)，從而加重心肌損傷[12]。CC類(lèi)趨化因子受體2(CCR2)是MCP-1的特異性受體，可以介導(dǎo)單核細(xì)胞聚集并遷移浸潤(rùn)到血管壁內(nèi)，促進(jìn)AS的形成。Hayasaki等[13]將小鼠CCR2基因敲除后，其缺血再灌注心肌炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著降低，心肌梗死面積縮小。MIF是一種新型炎癥因子，主要由單核細(xì)胞核內(nèi)皮細(xì)胞分泌，具有多種獨(dú)特的性能和效能，可刺激巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，在AS及不穩(wěn)定斑塊的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。此外，MIF還可誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)并經(jīng)由MCP-1的作用機(jī)制使巨噬細(xì)胞發(fā)生聚集，直接或間接地刺激巨噬細(xì)胞分泌一些細(xì)胞因子，產(chǎn)生炎癥放大效應(yīng)[14]。TNF-α是體內(nèi)重要的炎癥因子，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可通過(guò)自分泌方式作用于其他巨噬細(xì)胞，引起更多巨噬細(xì)胞的活化，從而放大炎癥反應(yīng)。MCP-1、MIF與TNF-α相互之間的作用，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，在啟動(dòng)和促進(jìn)心肌細(xì)胞的再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

珠子參對(duì)改善缺血性損傷具有廣泛的藥理作用[5]。既往研究表明，珠子參總皂苷對(duì)心肌缺血性損傷具有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗氧化損傷有關(guān)[15]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α濃度顯著升高，珠子參總皂苷干預(yù)組大鼠血清 MCP-1、MIF與TNF-α的水平都明顯下降，提示珠子參總皂苷對(duì)MIRI大鼠心肌的保護(hù)作用機(jī)制可能與其抑制MCP-1、MIF和TNF-α的表達(dá)有關(guān)。