甘肅省大麥條紋病菌遺傳多樣性及致病力差異

李葆春 司二靜 楊淑蓮

摘要 為了解甘肅省大麥條紋病病原菌Pyrenophora graminea的遺傳多樣性及致病力差異，運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)大麥條紋病菌不同菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，并采用三明治法進(jìn)行菌株致病力差異研究。結(jié)果表明：17個(gè)RAPD標(biāo)記從45個(gè)菌株中擴(kuò)增出126條帶，平均每個(gè)標(biāo)記7.41條帶，遺傳相似系數(shù)范圍為0.468 3～0.984 1，平均值為0.830 8，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.723 6時(shí)，可將供試菌株劃分為4個(gè)類群，分別包含41、2、1和1個(gè)菌株;致病力測(cè)定結(jié)果顯示菌株QWC較菌株QQ致病力強(qiáng)，兩菌株除在品種‘甘啤2號(hào)和‘GP3上無(wú)致病力外，在其他供試品種上致病力均存在差異。表明大麥條紋病菌不同菌株間存在遺傳差異，且菌株QWC和菌株QQ存在致病力差異。

關(guān)鍵詞 大麥條紋病菌; 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA; 遺傳多樣性; 致病力差異

中圖分類號(hào)： S 435.123

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018287

Abstract The genetic diversity of Pyrenophora graminea collected from different regions in Gansu， was detected with RAPD markers， and the virulence difference between isolate QQ and isolate QWC was tested by the sandwich method. The results showed that a total of 126 fragments were obtained from 45 isolates. Among them， all of the fragments were polymorphic， with an average of 7.41 fragments per RAPD marker. The genetic similarity ranged from 0.468 3 to 0.984 1， with the average of 0.830 8. Isolates in the study were classified into 4 groups at a genetic similarity level of 0.723 6. Virulence test showed that isolate QWC had higher virulence than isolate QQ， and isolate QWC and isolate QQ had virulence difference on all barley varieties except ‘Ganpi 2 and ‘GP3， which were immune to isolate QWC and isolate QQ. The results indicated that there was genetic difference among 45 isolates and a clear virulence differentiation between isolate QWC and isolate QQ.

Key words Pyrenophora graminea; RAPD; genetic diversity; virulence differentiation

大麥作為全球第四大禾谷類作物，與其他麥類作物相比，其抗旱、耐瘠和耐鹽性更強(qiáng)，在全世界廣泛種植，而我國(guó)大麥貿(mào)易長(zhǎng)期處于凈進(jìn)口狀態(tài)[1]。經(jīng)過(guò)育種工作者多年的努力，目前已經(jīng)育成部分品種，緩解了我國(guó)啤酒大麥?zhǔn)袌?chǎng)的供求矛盾。隨著我國(guó)人均啤酒消費(fèi)量的上升、人口的增加以及大麥糧草雙高育種目標(biāo)的提出，對(duì)啤用大麥需求進(jìn)一步加大，但我國(guó)大麥生產(chǎn)和發(fā)展過(guò)程受到大麥條紋?。╞arley leaf stripe）的影響，該病害是由麥類核腔菌Pyrenophora graminea （anamorph Drechslera graminea）[（Rabenh. ex. Schlech.）Shoemaker]引起的種傳病害，在大多數(shù)大麥種植地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，導(dǎo)致大麥嚴(yán)重減產(chǎn)[23]。大麥條紋病主要發(fā)生在北美、北非、俄羅斯、歐洲、印度和中國(guó)等。國(guó)內(nèi)該病害主要分布在沿長(zhǎng)江流域的浙江、江蘇、四川、甘肅河西走廊地區(qū)以及青藏高原裸大麥區(qū)等。近年來(lái)大麥條紋病在我國(guó)江蘇、浙江、四川和湖北等地的重病區(qū)平均發(fā)病率高達(dá)35.3%[4]，河西走廊玉門(mén)市發(fā)病率達(dá)60%，造成30%～40%的產(chǎn)量損失[5]，甘肅省古浪縣重病田塊發(fā)病率達(dá)到27%[6]。

大麥條紋病菌遺傳多樣性分析國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，Jawhar等[7]運(yùn)用12個(gè)隨機(jī)引物對(duì)來(lái)自敘利亞不同地區(qū)的大麥條紋病菌進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明不同菌株間有明顯遺傳差異;王春明等[8]運(yùn)用10個(gè)隨機(jī)引物對(duì)甘肅省的11個(gè)大麥條紋病菌標(biāo)樣進(jìn)行RAPD分析，11個(gè)供試菌株間遺傳距離為0.02～0.31。Bayraktar等[9]對(duì)采自不同地區(qū)大麥條紋病菌進(jìn)行ITSRFLP和ISSR分析，ITSRFLP結(jié)果顯示供試菌株間無(wú)差異，而ISSR分析顯示供試菌株可劃分為4個(gè)簇。司二靜等[10]利用ISSR標(biāo)記對(duì)甘肅省不同地區(qū)的大麥條紋病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明90.24%的片段具有多態(tài)性，遺傳相似系數(shù)為0.44～1，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.68時(shí)，可將供試菌株劃分為4個(gè)類群。

抗病育種是病害防治經(jīng)濟(jì)有效的途徑，抗性評(píng)價(jià)是抗病育種的前提條件，而不同菌株間致病力差異給抗性評(píng)價(jià)帶來(lái)了很大困擾，只有在明確菌株間致病力差異的基礎(chǔ)上才有可能獲得準(zhǔn)確的抗性評(píng)價(jià)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于大麥抗條紋病菌致病力差異已有報(bào)道，Tekauz[11]評(píng)價(jià)了3個(gè)菌株對(duì)57份大麥品種進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明3個(gè)菌株在致病力上存在顯著差異，WRS1237致病力最強(qiáng)而WRS1238致病力最弱。Gatti等[12]依據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率、致病力和蛋白類型進(jìn)行群體變異分析，將供試菌株劃分成無(wú)致病力、中等致病力和強(qiáng)致病力，且不同致病力的類群擁有不同的蛋白類型。Bayraktar等[9]在48個(gè)大麥品種上對(duì)13個(gè)菌株進(jìn)行致病力變異分析，結(jié)果顯示菌株存在很高的致病力變異。吳寬然[13]通過(guò)對(duì)13個(gè)菌株的侵染調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)各個(gè)菌株間的致病力差異較大。司二靜等[10]采用三明治法對(duì)43個(gè)大麥條紋病菌進(jìn)行致病力差異研究，其中強(qiáng)致病力、中等致病力和弱致病力菌株分別為2個(gè)、21個(gè)和20個(gè)，表明不同菌株間存在明顯致病力差異。目前關(guān)于甘肅省大麥條紋病菌在不同品種上的致病力差異研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)來(lái)源于甘肅省不同地區(qū)、不同年份的大麥條紋病菌運(yùn)用RAPD標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，并通過(guò)三明治法接種不同大麥品種進(jìn)行菌株間致病力差異研究，以期為深入開(kāi)展該病害的流行規(guī)律和抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：45個(gè)Pyrenophora graminea菌株由甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室麥類種質(zhì)創(chuàng)新課題組提供，菌株詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 45個(gè)大麥條紋病菌菌株RAPD分析

不同菌株DNA的提取參考改良CTAB法[910，14]。RAPD引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，菌株間表現(xiàn)多態(tài)性的引物信息見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增體系為10 μL：2×Master Mix 5 μL、10 μmoL/L引物1 μL、60 ng/μL模板1 μL，加ddH2O至10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s;37℃ 退火30s;72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 大麥條紋病菌菌株QWC和QQ的致病力測(cè)定

致病力測(cè)定方法采用三明治法[10，15]，將菌株QWC和QQ分別在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，在菌落邊緣打取菌餅，置于新PDA培養(yǎng)基上，在22℃下恒溫培養(yǎng)7 d，用來(lái)接種大麥種子。

種子用70%乙醇處理30 s，再用5%次氯酸鈉處理5 min，經(jīng)無(wú)菌水沖洗多次后將種子徹底晾干，然后將種子置于生長(zhǎng)7 d的兩層菌絲的PDA培養(yǎng)基中間，每個(gè)重復(fù)接種30粒大麥種子，每個(gè)品種3次重復(fù)，6℃黑暗放置20 d后轉(zhuǎn)移至直徑12 cm花盆，L∥D=12 h∥12 h，培養(yǎng)45 d后待病斑完全顯現(xiàn)時(shí)進(jìn)行觀察記載每次重復(fù)的全部幼苗數(shù)，及出現(xiàn)癥狀的幼苗數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將電泳結(jié)果DNA圖譜中清晰且可重復(fù)的條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，利用軟件NTSYSpc 2.10e計(jì)算各菌株間遺傳相似性系數(shù)（genetic similarity，GS），采用UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）法進(jìn)行聚類分析。

致病力劃分參照Bayraktar 等[9]：發(fā)病率>70%為強(qiáng)致病力， 20%<發(fā)病率≤70%為中等致病力，0<發(fā)病率≤20%為弱致病力，發(fā)病率=0為無(wú)致病力。

2 結(jié)果與分析

2.1 45個(gè)大麥條紋病菌菌株RAPD分析

17個(gè)RAPD引物在45個(gè)大麥條紋病菌中共擴(kuò)增出126條譜帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出7.41條帶。不同菌株間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.468 3～0.984 1， 菌株HJX1與LB2的遺傳相似系數(shù)最大，表明二者遺傳距離和遺傳差異均最小，菌株LB2與NH1的遺傳相似系數(shù)也較大，為0.976 2。菌株ZYM與QZ的遺傳相似系數(shù)最小，表明二者遺傳距離和遺傳差異均最大，菌株YPH與QZ的遺傳相似系數(shù)也較小，僅為0.484 1。供試菌株遺傳相似系數(shù)平均值為0.830 8，表明供試菌株間群體遺傳差異較小，可能是引物數(shù)量較少所致，也可能與菌株主要來(lái)源于河西地區(qū)有關(guān)。

2.2 聚類分析

以UPGMA法對(duì)供試的45個(gè)菌株構(gòu)建聚類圖，在遺傳相似系數(shù)為0.540 0時(shí)，可劃分為2類群，菌株QZ單獨(dú)為一類群，剩余菌株構(gòu)成第二類群; 0.723 6時(shí)可將供試菌株劃分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ為4個(gè)類群，分別包含41、2、1和1個(gè)菌株，其中菌株DQ2和菌株QZ各為一類，菌株HZZ和ZHZH構(gòu)成一類，而剩余41個(gè)菌株劃分為一類（圖1）。本研究中菌株來(lái)源于不同地區(qū)，通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)采集于同一地區(qū)的菌株未被聚在一起，如DQ和DQ2均來(lái)源于甘肅玉門(mén)東渠同一田塊的不同感病植株，但被劃分在不同類群中，表明菌株DQ和DQ2間存在一定遺傳差異，此外來(lái)源于內(nèi)蒙古的菌株SKL與來(lái)源于甘肅永昌的XSB聚在一起，遺傳相似系數(shù)較大，因此基于RAPD分析結(jié)果表明大麥條紋病菌菌株類群與菌株的地理來(lái)源間沒(méi)有明顯的相關(guān)性。

2.3 菌株QWC和QQ的致病力差異

將菌株QWC和QQ分別接種于62份不同來(lái)源的大麥品種上研究其致病力差異。結(jié)果表明，接種菌株QWC的大麥材料的發(fā)病率為0～90.12%，接種菌株QQ的發(fā)病率為0～66.67%;在62個(gè)大麥品種上接種QWC和QQ平均發(fā)病率分別為38.28%和10.04%，分別表現(xiàn)為中等致病力和弱致病力，菌株QWC致病力與菌株QQ相比較強(qiáng)。菌株QWC在62個(gè)品種上的致病力表現(xiàn)依次為9個(gè)品種上表現(xiàn)強(qiáng)致病力、36個(gè)品種上表現(xiàn)為中等致病力和11個(gè)品種上表現(xiàn)為弱致病力，6個(gè)品種上表現(xiàn)為無(wú)致病力;菌株QQ對(duì)供試62個(gè)品種均未表現(xiàn)出強(qiáng)致病力，在12個(gè)品種上表現(xiàn)為中等致病力，30個(gè)品種上表現(xiàn)為弱致病力，20個(gè)品種上表現(xiàn)為無(wú)致病力（表3）。QWC和QQ除在品種‘甘啤2號(hào)和‘GP3上表現(xiàn)為無(wú)致病力外，在多數(shù)品種上致病力差異較大。在整體水平上雖然菌株QWC比菌株QQ致病力強(qiáng)，但是在個(gè)別品種上菌株QQ比菌株QWC致病力強(qiáng)，如在‘BARI193和‘內(nèi)08PJ36上菌株QWC表現(xiàn)為無(wú)致病力而菌株QQ表現(xiàn)為中等致病力?；诓煌贩N對(duì)供試菌株的反應(yīng)差異表明菌株QWC和菌株QQ存在明顯的致病力差異。

3 討論

寄主與病原菌的自身特點(diǎn)及相互關(guān)系對(duì)抗病育種和病害防治具有非常重要的指導(dǎo)意義，兩者是相互斗爭(zhēng)相互依存關(guān)系，而病原菌遺傳多樣性和致病力差異對(duì)病害防治尤為重要，本研究通過(guò)RAPD方法對(duì)不同來(lái)源的大麥條紋病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，并通過(guò)人工接種方法對(duì)不同菌株進(jìn)行致病力差異研究。

本研究結(jié)果顯示RAPD分析可以揭示供試菌株間遺傳差異，與Jawhar等[7] 和王春明等[8]的結(jié)果較一致，并且本研究選取的引物數(shù)量多于前者，本研究篩選到17條在供試菌株間表現(xiàn)多態(tài)性引物，而Jawhar等[7]和王春明等[8]分別只篩選到9條和2條多態(tài)性RAPD引物。本試驗(yàn)RAPD分析結(jié)果顯示擴(kuò)增譜帶在菌株間均表現(xiàn)多態(tài)性，與王春明等[8]報(bào)道的46.15%相比較高，產(chǎn)生此差異可能與本研究中所用菌株數(shù)量較多，且地理來(lái)源更加豐富有關(guān)。菌株GKM采集于甘肅省甘南青稞感病植株，而聚類結(jié)果顯示菌株GKM與來(lái)源于甘肅古浪的菌株SSH遺傳差異較小，聚在一起，這與王春明等[8]報(bào)道的菌株類群與不同寄主有一定的相關(guān)性的研究結(jié)論不一致，可能與供試菌株數(shù)量有關(guān)。本研究結(jié)果表明RAPD聚類與河西地區(qū)菌株地理來(lái)源無(wú)相關(guān)性，與Bayraktar等[9]的研究結(jié)果相一致，造成該現(xiàn)象的原因與大麥條紋病為種傳病害有關(guān)，同一地區(qū)不同地塊種子來(lái)源地不同，不同種植區(qū)域間的種子調(diào)運(yùn)對(duì)病原菌在不同地理區(qū)域間的傳播也起到重要的作用。

本研究通過(guò)不同品種經(jīng)人工接種不同菌株后的發(fā)病率對(duì)不同菌株進(jìn)行致病力差異研究，結(jié)果顯示不同菌株間致病力差異較大，與前人研究結(jié)果[10， 13]相一致。司二靜等[10]在大麥品種‘Isotta上對(duì)43株大麥條紋病菌進(jìn)行致病力測(cè)定，其中菌株QWC和菌株QQ分別劃分為強(qiáng)致病力菌株和弱致病力菌株，而本研究選取菌株QWC和菌株QQ在62份大麥上進(jìn)行致病力測(cè)定，結(jié)果顯示菌株QWC較菌株QQ致病力強(qiáng)，與司二靜等[10]的研究結(jié)果一致。因菌株QWC和菌株QQ存在明顯致病力差異，在部分品種上菌株QWC表現(xiàn)無(wú)致病力，但是菌株QQ卻能使該品種致病，如‘BARI193和‘內(nèi)08PJ36。本研究只篩選到品種‘甘啤2號(hào)和‘GP3對(duì)菌株QWC和菌株QQ均表現(xiàn)為抗病，接種后未發(fā)現(xiàn)感病植株，后續(xù)應(yīng)考慮通過(guò)構(gòu)建遺傳群體在免疫品種中挖掘抗性基因或QTL，進(jìn)而更好地為大麥條紋病的抗病育種提供抗性資源。

由于本研究中只選用了40條RAPD引物中多態(tài)性較高的17條RAPD對(duì)供試菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，若要更加詳細(xì)地進(jìn)行甘肅省大麥條紋菌的遺傳多樣性分析，還需進(jìn)行大量的RAPD引物篩選或采用其他標(biāo)記方法進(jìn)行相關(guān)研究。 本研究只選用菌株QWC和菌株QQ在不同大麥品種上進(jìn)行致病力差異研究，后續(xù)應(yīng)選取更多菌株在不同品種上進(jìn)行致病力差異研究，通過(guò)菌株間遺傳差異和致病力差異為大麥條紋病抗病育種和病原菌致病機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 李先德，孫致陸，張京.2014年世界和中國(guó)大麥生產(chǎn)與貿(mào)易形勢(shì)及2015年展望[J].農(nóng)業(yè)展望，2015，11（2）：4347.

[2] ARABI M I E， JAWHAR M， ALSAFADI B， et al. Yield responses of barley to leaf stripe （Pyrenophora graminea） under experimental conditions in southern Syria [J]. Journal of Phytopathology， 2004， 152（8/9）： 519523.

[3] PORTAPUGLIA A， DELOGU G， VANNACCI G.Pyrenophora graminea on winter barley seed： effect on disease incidence and yield losses[J]. Journal of Phytopathology，1986，117（1）：2633.

[4] 陳桂華，褚金云，金保根，等.金山區(qū)大麥條紋病暴發(fā)情況及原因分析[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2009（5）：134.

[5] 靳生杰，洪平，張麗瓊.玉門(mén)市大麥條紋病的發(fā)生與防治[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2008（13）：3536.

[6] 司二靜.大麥條紋病病原菌基因組測(cè)序及SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[7] JAWHAR M， SANGWAN R S， ARABI M I E.Identification of Drechslera graminea isolates by cultural characters and RAPD analysis [J].Cereal Research Communications，2000，28（1）：8793.

[8] 王春明，鄭果，洪流，等.甘肅省不同地區(qū)大麥條紋病病菌致病力測(cè)定及RAPD分析[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊，2014，34（4）：1014.

[9] BAYRAKTAR H， AKAN K. Genetic characterization of Pyrenophora graminea isolates and the reactions of some barley cultivars to leaf stripe disease under greenhouse conditions[J]. Turkish Journal of Agriculture and Forestry， 2012， 36（2）： 329339.

[10]司二靜，楊淑蓮，李葆春，等.甘肅省大麥條紋病病原菌致病力分化、rDNAITS及遺傳多樣性分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2017，44（1）：8492.

[11]TEKAUZ A. Reaction of Canadian barley cultivars to Pyrenophora graminea， the incitant of leaf stripe [J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 1983， 5（4）： 294301.

[12]GATTI A， RIZZA F，DELOGU G， et al. Physiological and biochemical variability[of the barley] in a population of Drechslera graminea[J]. Journal of Genetics & Breeding，1992，46：179186.

[13]吳寬然.大麥條紋病菌種群遺傳結(jié)構(gòu)分析及抗性種質(zhì)鑒定[D].杭州：浙江師范大學(xué)，2013.

[14]WEILAND J J， STEFFENSON B J， CARTWRIGHT R D， et al. Identification of molecular genetic markers in Pyrenophora teres f. teres associated with low virulence on ‘Harbin barley[J]. Phytopathology， 1999， 89（2）： 176181.

[15]PECCHIONI N， FACCIOLI P， TOUBIARAHME H， et al. Quantitative resistance to barley leaf stripe （Pyrenophora graminea） is dominated by one major locus[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1996， 93（1/2）： 97101.

（責(zé)任編輯：楊明麗）