海南芒果可可球二孢的致病力及其對多菌靈抗性

曾耿狄 符可芯 劉樂

摘要 從海南5個芒果主產(chǎn)區(qū)采集分離芒果蒂腐病菌可可球二孢菌株，采用室內(nèi)人工接種的方法對110個可可球二孢菌株進行致病力測定，采用區(qū)分劑量法和菌絲生長速率法測定其中106個菌株對多菌靈的抗性。結(jié)果表明：芒果蒂腐病自然發(fā)病率29.37%;人工接種的發(fā)病率100.00%，110株可可球二孢菌株中強致病力、中等致病力及弱致病力菌株分別占64.55%、25.45%和10.00%;在106株可可球二孢菌株中，抗性菌株發(fā)生頻率為52.83%，其中高抗菌株可在含100 mg/L多菌靈培養(yǎng)基上生長，發(fā)生頻率為45.28%，中抗菌株在含100 mg/L多菌靈培養(yǎng)基上不能正常生長，抗性頻率為7.55%;沒有發(fā)現(xiàn)低抗菌株。多菌靈對可可球二孢田間分離菌株EC50的頻率分布為不連續(xù)分布，研究結(jié)果表明海南地區(qū)危害芒果的可可球二孢對多菌靈抗性非常嚴重。

關鍵詞 芒果; 可可球二孢; 致病力; 多菌靈; 抗藥性

中圖分類號： S 436.67

文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018498

Abstract The strains of Botryodiplodia theobromae were collected and separated from mango infected by stem end rot in five main mango producing areas of Hainan. The virulence of 110 B. theobromae strains were determined by the artificial inoculation. The resistance of 106 strains to carbendazim were tested by distinguishing dosage method and mycelial growth rate method. The results showed that the incidence of mango stem end rot was 29.37% and 100% under natural and artificial inoculation conditions， respectively. In total of 110 strains， the high virulent strains， median virulent strains， and the low virulent strains accounted by 64.55%， 25.45% and 10.00%， respectively. The resistance frequency of 106 strains to carbendazim was 52.83%. Among them， high resistance strains could grow on media containing 100 mg/L carbendazim with the resistance frequency of 45.28%， the median resistance strains not grow normally on the media containing 100 mg/L carbendazim with the resistance frequency of 7.55%， and no low resistance strains were found. The carbendazim sensitivity frequency showed noncontinuous distribution. All data showed that B. theobromae from mango had serious resistance to carbendazim in Hainan.

Key words mango; Botryodiplodia theobromae; virulence; carbendazim; fungicide resistance

芒果Mangifera indica L.屬漆樹科芒果屬，是一種重要的熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物，產(chǎn)量在熱帶水果中排第三位[1]。我國是芒果的主要生產(chǎn)國之一，主要在海南、廣西、福建、臺灣等熱帶亞熱帶地區(qū)種植[2]。至2007年，海南省芒果種植面積46 940 hm2，產(chǎn)量30.98 萬t，種植面積和產(chǎn)量僅次于香蕉[3]。目前海南芒果主要以陵水、樂東、東方、三亞和昌江為主產(chǎn)區(qū)，5個市縣的栽培面積和產(chǎn)量占全省芒果栽培面積和產(chǎn)量的80%以上[4]。蒂腐病會引起芒果果實迅速腐爛，是芒果貯存期除芒果炭疽病外的第二大病害，對芒果的品質(zhì)、運輸產(chǎn)生嚴重的危害，造成巨大的經(jīng)濟損失[5]。引起芒果采后蒂腐病的病原有3種，分別是可可球二孢Botryodiplodia theobromae Pat.、多米尼加小穴殼菌Dothiorella dominicana Pet. et Cif.及芒果擬莖點霉Phomopsis mangiferae Ahmad [67]?？煽汕蚨邚V泛存在于世界各芒果種植地，在中國、印度、菲律賓及韓國等均有分布[89]，在海南，可可球二孢是引起芒果蒂腐病的第一大病原菌。該菌具有潛伏期長，發(fā)病迅速等特點。由于該病原菌在大田期間就已侵入芒果，而芒果種植期間大量頻繁使用殺菌劑防治各種病害，對芒果蒂腐病病原菌造成了很大的藥劑選擇壓力[10]，使得該病菌面臨產(chǎn)生嚴重抗藥性的風險。苯并咪唑類殺菌劑多菌靈是一類高效、廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑，也是多數(shù)苯并咪唑類殺菌劑的水解產(chǎn)物和有效成分。多菌靈對子囊菌亞門和擔子菌亞門中的大多數(shù)病原真菌有效，主要作用于真菌體內(nèi)的β微管蛋白，影響真菌的生長繁殖。

苯并咪唑類殺菌劑多菌靈曾是防治芒果田間及采后病害最重要的殺菌劑之一[11]。本課題組從2014年開始監(jiān)測海南芒果主產(chǎn)區(qū)可可球二孢對多菌靈的抗性，發(fā)現(xiàn)其對多菌靈的抗藥性普遍嚴重。2018年再次從海南芒果主要產(chǎn)區(qū)采集病果，分離、純化可可球二孢，測定其對多菌靈的抗性，旨在進一步明確可可球二孢對多菌靈的抗性水平，在田間已經(jīng)減少多菌靈使用的情況下，比較抗藥性群體的變化及抗性特性，為海南芒果蒂腐病的科學防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試藥劑

97.2%多菌靈原藥，海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司。用0.1 mol/L稀鹽酸溶解，然后用0.1%吐溫80溶液定容，配制成50 000 mg/L母液備用。

1.1.2 供試菌株

供試可可球二孢Botryodiplodia theobromae菌株均為本實驗室從感病芒果分離、鑒定與保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試菌株的分離、純化、鑒定與保存

將從海南陵水、樂東、東方、三亞和昌江5個芒果主產(chǎn)區(qū)采回的芒果于室溫貯藏，待芒果完成后熟，選擇出現(xiàn)芒果蒂腐病的果實，采用組織分離法分離病原菌。即從病果沿病健交接處取5 mm×5 mm的小塊，用0.1%升汞酒精消毒60 s，再用無菌水清洗3次后置于PDA平板上，待菌落長出后，從單個菌落邊緣打取菌餅轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上進行純化培養(yǎng)。觀察菌落的形態(tài)、顏色及分生孢子形態(tài)，將鑒定為可可球二孢的菌株按柯赫法則回接芒果，確認為致病菌后將其轉(zhuǎn)移到PDA斜面上培養(yǎng)7 d，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 可可球二孢對芒果的致病力測定

致病力測定采用室內(nèi)離體菌絲接種法： 將110個供試菌株于28℃恒溫培養(yǎng)4 d，分別在各菌株菌落邊緣打取菌餅（d=5 mm）。芒果待接種部位先用針頭刺傷，再接種菌餅。芒果品種為‘紅金龍，每個果實接種3點，每處理接種3個果實，以接種無菌瓊脂塊為對照，室溫下保濕培養(yǎng)。接種第2天開始檢查、統(tǒng)計果實發(fā)病情況，并測量病斑直徑，計算發(fā)病率和病情指數(shù)（DI）。

DI=∑[各級病葉（果）數(shù)×相對級值]調(diào)查總?cè)~（果）數(shù)×9×100。

參照芒果炭疽病嚴重度分級標準[12]，以病斑直徑（X）進行分級。0級，X=0;1級，04.0 cm。致病力劃分參照文獻[11]，以相同時間內(nèi)病果病情指數(shù)進行劃分，強致病力：病情指數(shù)≥70;中致病力：病情指數(shù)為40～69;弱致病力：病情指數(shù)<40。

1.2.3 可可球二孢對多菌靈抗藥性測定

1） 可可球二孢對多菌靈的抗性初步檢測

采用菌絲生長速率法測定106個可可球二孢對多菌靈的敏感性。多菌靈濃度設置為1、10和100 mg/L（質(zhì)量濃度），以不含多菌靈的PDA培養(yǎng)基為空白對照。每處理3個重復，試驗重復2次。菌株在PDA上培養(yǎng)3 d后打取5 mm菌餅分別接種于含藥及空白培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h和48 h，用十字交叉法測量菌落直徑，并計算菌絲生長抑制率。參照喬廣行等[13]和吳永官等[14]的文獻，在含1 mg/L藥劑的PDA平板上生長受到明顯抑制，含10 mg/L藥劑的平板上幾乎不能生長的菌株判定為敏感菌株（S）;在含10 mg/L藥劑的PDA平板上生長受到的抑制不明顯，在含100 mg/L藥劑的PDA平板上抑制率大于50%為中抗菌株（MR）;在含10 mg/L藥劑的PDA平板上能正常生長，在含100 mg/L藥劑的PDA平板上抑制率小于50%為高抗菌株（HR）。

2） 可可球二孢對多菌靈的敏感性測定

在初步檢測的基礎上針對不同菌株分別設計多菌靈的供試濃度，其中敏感菌株的供試濃度為：0.005、001、0.05、0.25、1.25、6.25 mg/L，抗性菌株的供試濃度為：10、50、100、500、1 000、2 000 mg/L。菌株在PDA上培養(yǎng)3 d后用5 mm直徑打孔器打取菌餅，分別接種到6個不同濃度梯度的含藥培養(yǎng)基上及不含藥的培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每濃度設置3個重復，于36 h和48 h用十字交叉法測量菌落直徑，并根據(jù)藥劑濃度對數(shù)和菌絲生長抑制率用DPS 和Microsoft Excel 2013軟件計算出各菌株的毒力回歸方程和EC50。

根據(jù)初步測定結(jié)果，結(jié)合吳永官等[14]的方法進行抗性等級的劃分：在含10 mg/L （質(zhì)量濃度）藥劑的PDA上菌落直徑小于空白對照的40%為敏感菌株（S）;在含10 mg/L藥劑的PDA上菌落直徑大于空白對照的40%，但在含100 mg/L藥劑的PDA上菌落直徑小于空白對照的40%為中等抗性菌株（MR）;在含100 mg/L藥劑的PDA上菌落直徑超過空白對照的40%為高抗菌株（HR）。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果蒂腐病的發(fā)生及病原菌分離結(jié)果

本次試驗從陵水采集55個，樂東56個，東方97個，三亞123個，昌江47個共378個芒果，芒果完成后熟后出現(xiàn)帶有典型蒂腐病癥狀的芒果有111個，總發(fā)病率為29.37%。5個地區(qū)的自然發(fā)病率14.29%～47.27%（表1），其中樂東的發(fā)病率最低，陵水芒果的發(fā)病率最高。芒果品種中‘象牙芒的發(fā)病率遠遠高于其他品種，高達97.3%（圖1）。蒂腐病發(fā)病初期在果柄處出現(xiàn)黑褐色斑點，顏色比炭疽病病斑稍淺，隨后，病斑迅速擴展并導致芒果腐爛， 2～3 d芒果腐爛面積超過一半，果肉均腐爛，并出現(xiàn)酸臭味，完全不能食用。

2.2 可可球二孢不同菌株的致病力

部分菌株在接種48 h后果實上開始出現(xiàn)明顯水漬狀病斑;其他菌株接種后60 h果實上開始出現(xiàn)明顯水漬狀病斑，對照芒果均無發(fā)病。接種3 d后病斑呈暗褐色，無光澤，病健部交界明顯，在28～32℃下病斑迅速擴展，由暗褐色變?yōu)樯詈稚蜃虾谏?，接種5 d后果肉組織出現(xiàn)軟化、流汁癥狀，果面出現(xiàn)大量菌絲（圖2）。所有供試菌株接種5～7 d后，整個果實腐爛發(fā)臭。對110個菌株的致病力測定結(jié)果表明，強致病力菌株占64.55%，其中有20個菌株可使芒果的病情指數(shù)超過90，中等致病力菌株占25.45%，弱致病力菌株占10%。從芒果的采集地區(qū)來看，以樂東強致病力菌株最多，達86.67%，昌江地區(qū)的強致病力菌株最少僅占41.67%，東方、三亞及陵水的強致病力菌株在61.90%～72.22%之間。

2.3 可可球二孢對多菌靈抗性的初步檢測

剔除4個致病力極弱的菌株（病情指數(shù)小于10），采用區(qū)分劑量法對106個菌株進行抗性初步測定，結(jié)果（表2）表明，敏感性菌株為50個，占47.17%;抗性菌株為56個，抗性頻率為52.83%，其中8個菌株為中抗菌株，發(fā)生頻率為7.55%;48個菌株為高抗菌株，發(fā)生頻率為45.28%。海南各地抗性菌株的發(fā)生頻率存在差異，抗性頻率在0～95.65%之間。其中，樂東和三亞芒果主產(chǎn)區(qū)的菌株抗性頻率較高，東方和陵水芒果上分離的菌株的抗性較低，昌江本次沒有發(fā)現(xiàn)抗性菌株，說明可可球二孢對多菌靈的抗性在海南省存在普遍性和地區(qū)差異性，且各地區(qū)之間差異較大。

2.4 可可球二孢對多菌靈抗性水平測定

采用生長速率法，分別設計5～7個藥劑濃度測定多菌靈對上述菌株的毒力，計算EC50。50個敏感菌株在含1 mg/L多菌靈的PDA平板上均不能正常生長，EC50在0.001～1 mg/L之間，平均值為0.18 mg/L;中抗菌株在含100 mg/L多菌靈的PDA平板上不能正常生長，10 mg/L

所有田間分離菌株對多菌靈的敏感性頻率分布見圖3，可以看出，多菌靈對可可球二孢田間分離菌株EC50的頻率分布呈現(xiàn)典型的雙峰趨勢，為不連續(xù)分布，抗性呈質(zhì)量遺傳特性，具有抗性水平高、進化快、固有抗性風險高的特點。

3 討論

大量研究表明，苯并咪唑類殺菌劑存在高抗性風險，是現(xiàn)有殺菌劑中病原菌產(chǎn)生抗性最為嚴重的藥劑。多菌靈屬于苯并咪唑類殺菌劑，因其殺菌譜廣，內(nèi)吸性強，防病效果好，被廣泛應用于防治多種病害，但由于其作用位點單一，病原菌極易產(chǎn)生抗藥性[15]。周明國等報道引起小麥赤霉病的禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum在華北地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)了對多菌靈有高水平抗性的菌株[16]。灰霉病菌Botrytis cinerea是產(chǎn)生抗性較早的病原菌之一[1718]， 對苯并咪唑類中的多菌靈，N苯基氨基甲酸酯類的乙霉威等均產(chǎn)生了抗性，甚至是多重抗性[19]。劉慧平等對山西各地區(qū)的灰霉病菌進行了抗藥性監(jiān)測，結(jié)果顯示山西各地灰霉菌對多菌靈的抗性均較為嚴重[20]。另外，鏈格孢屬Alternaria[21]、葡萄炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides[22]、蘋果輪紋病菌Botryosphaeria dothidea[23]、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides[24]、匍柄霉屬Stemphylium[25]、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum[26]、黃瓜黑星病菌Cladosporium cucumerinum[27]等都對多菌靈產(chǎn)生了抗性。2010年師超等發(fā)現(xiàn)抗多菌靈的芒果蒂腐病菌可可球二孢對甲基硫菌靈的平均EC50高于1 000 mg/L[28]。2015年王萌、陳小莉等發(fā)現(xiàn)芒果蒂腐病菌可可球二孢對苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈和多菌靈的抗性頻率分別為87.5%和90.1%[29]。本研究結(jié)果表明在海南省芒果主產(chǎn)區(qū)的可可球二孢菌對多菌靈產(chǎn)生了很強的抗藥性，但是相比前幾年的結(jié)果，抗性頻率有所下降，這可能與抗性等級劃分的標準不同有關。如果以單劑量為區(qū)分劑量標價抗性，往往會過高估計抗性頻率。根據(jù)我們此次針對芒果蒂腐病菌可可球二孢以區(qū)分劑量的初步檢測及精密毒力測定所得的EC50來看，敏感菌株在含1 mg/L多菌靈的培養(yǎng)基上就會受到明顯的抑制，其EC50小于1 mg/L;中抗菌株在含100 mg/L多菌靈的培養(yǎng)基上受到明顯抑制，10 mg/L100 mg/L，按這個標準進行分級，區(qū)分劑量法與生長速率法兩種測定方法，抗性分級的結(jié)果比較一致，可用于以后可可球二孢對多菌靈的抗性檢測。此外，抗性頻率的下降可能和近年來海南芒果主產(chǎn)區(qū)多菌靈的使用量減少有關。對多菌靈產(chǎn)生抗性的可可球二孢菌株保持著跟敏感菌株一樣的致病力，說明菌株的適合度高;同時，抗性菌株的抗性水平仍然非常高，田間抗性菌株主要為高水平抗性菌株，抗藥性水平并沒有下降的趨勢，也說明此類藥劑產(chǎn)生抗性后的風險極高。

2015年陳小莉等研究發(fā)現(xiàn)，從陵水、樂東、三亞與昌江分離的124株芒果可可球二孢，強致病力菌株占28.23%，中等致病力菌株占66.93%，弱致病力菌株占4.84%[12]。本研究對110個菌株的致病力測定結(jié)果表明，分離出來的強致病力菌株比例最高，占64.55%，中等致病力菌株占25.45%，弱致病力菌株占10.00%。從采集地區(qū)來看，以樂東強致病力菌株最多，達86.67%，昌江地區(qū)的強致病力菌株最少僅占41.67%，東方、三亞及陵水的強致病力菌株在61.90%～72.22%之間。這可能跟昌江的芒果種植業(yè)發(fā)展比較晚有關。

目前海南省多菌靈抗性菌株分布相對較廣，并且多為高抗菌株，這也許和芒果蒂腐病菌可可球二孢基因自然突變有關，后續(xù)將會針對病菌抗藥性的分子機制展開研究。但是，鑒于該病菌對多菌靈已產(chǎn)生嚴重的抗性，限制其在海南芒果上使用，并且選用作用機制不同的化學藥劑進行復配等綜合防治策略對提高芒果蒂腐病防治效率等尤為重要。

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（責任編輯：楊明麗）