南寧市桑白粉病病原菌種類鑒定

韓寧寧 黃元騰吉 李峰

摘要 桑白粉病是桑樹的重要病害，分為桑里白粉病和桑表白粉病。通過形態(tài)特征觀察和ITS、D1/D2序列分析，明確桑里白粉病的病原菌為桑生球針殼Phyllactinia moricola;桑表白粉病的病原菌為桑白粉菌Erysiphe mori。桑鉤絲殼Uncinula mori是桑白粉菌的異名。

關(guān)鍵詞 桑里白粉病; 桑生球針殼; 桑表白粉病; 桑白粉菌

中圖分類號(hào)： S 888.716

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018327

Abstract Powdery mildew is an important disease on mulberry， which is divided into mulberry powdery mildew on leaf back and mulberry powdery mildew on leaf surface. Based on morphological characteristic and the nucleotide sequences of ITS and D1/D2， it was confirmed that the pathogen causing powdery mildew on the leaf back was Phyllactinia moricola， and the pathogen causing powdery mildew on the leaf surface of mulberry was Erysiphe mori.Uncinula mori is the synonym of Erysiphe mori.

Key words mulberry powdery mildew on leaf back; Phyllactinia moricola; mulberry powdery mildew on leaf surface; Erysiphe mori

隨著國(guó)家“東桑西移”戰(zhàn)略的實(shí)施，近年來廣西大力發(fā)展桑蠶業(yè)，2012年，廣西桑園面積16.88萬hm2，蠶繭產(chǎn)量25.60萬t，蠶絲產(chǎn)量2.88萬t[1]，位居全國(guó)第一;至今，在全國(guó)范圍內(nèi)，廣西桑蠶產(chǎn)業(yè)仍占第一位[2]。桑白粉病是桑上的一種重要病害，病害的發(fā)生導(dǎo)致桑葉產(chǎn)量降低、質(zhì)量變劣，喂食感染白粉病的桑葉的家蠶體質(zhì)弱，易誘發(fā)蠶病，蠶繭量、繭層量、繭層率均降低，嚴(yán)重影響蠶絲產(chǎn)業(yè)[3]。根據(jù)白粉產(chǎn)生的部位不同分為桑里白粉病和桑表白粉病。桑里白粉病在桑葉背面產(chǎn)生白粉斑，在白粉斑相應(yīng)的桑葉正面可見淡黃褐色病斑[3];桑表白粉病可在桑葉正背面產(chǎn)生白粉斑，但以葉面為主。有關(guān)桑白粉病的病原菌種類，早年鄭儒永等[4]根據(jù)形態(tài)特征和寄主范圍鑒定桑里白粉病的病原菌為桑生球針殼Phyllactinia moricola，桑表白粉病的病原菌為桑鉤絲殼Uncinula mori;隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和核苷酸序列的分析，白粉菌的分類系統(tǒng)被多次修訂，多種植物白粉病病原菌的種名也發(fā)生了變化。有關(guān)桑白粉病菌的分子生物學(xué)鑒定，僅見楊俐針對(duì)來自云南的菌株進(jìn)行了鑒定，報(bào)道桑里白粉病的病原菌為桑生球針殼P.moricola[5]，但未見基于分子生物學(xué)基礎(chǔ)鑒定桑表白粉病菌種類的報(bào)道。本文針對(duì)南寧市發(fā)生的桑里白粉病和桑表白粉病，結(jié)合形態(tài)特征和分子生物學(xué)技術(shù)，鑒定其病原菌的種類，對(duì)規(guī)范使用桑白粉病菌的學(xué)名具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 桑白粉病標(biāo)本的采集及其病原菌形態(tài)特征觀察

于廣西大學(xué)農(nóng)場(chǎng)采集桑白粉病標(biāo)本，用刀片輕輕刮取葉片表面的白色粉狀物、用毛筆輕輕掃下桑葉片表面的黑色小顆粒，用光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CX31）觀察病原菌的形態(tài)特征。

參考陳廷速等[6]的甘蔗根系染色方法稍作改進(jìn)后對(duì)桑白粉病病葉進(jìn)行脫色，觀察病原菌的菌絲體形態(tài)特征。透明：將發(fā)病嫩葉切成1 cm×1 cm的正方形小塊，放入50 mL離心管中，加入20%KOH溶液浸沒葉片，離心管放入90℃的水浴鍋中，水浴90 min，取出后室溫放置20 d;脫色：將浸泡20 d的離心管中的KOH溶液倒掉，加入堿性H2O2（10%的H2O2 30 mL，氨水3 mL，蒸餾水967 mL），漂白60 min;染色：將離心管中的脫色液倒掉，加入5%乙酸95 mL和黑墨水5 mL的混合液，66℃水浴染色30 min;褪色：染色完成后，倒去染色液，用清水沖洗數(shù)次，然后清水浸泡30 min。將葉片取出置于載玻片上，蓋上蓋玻片輕壓，用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2 病原菌ITS和28S rRNA D1/D2區(qū)域序列分析

用毛筆分別掃下桑里白粉病葉片背面的白色粉狀物、桑表白粉病葉片正面的黑色小顆粒，用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit（杭州博日科技有限公司）提取真菌基因組DNA，用真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）和28S rRNA D1/D2區(qū)域引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ITS引物：ITS1： 5′TCC GTA GGT GAA CCT GCG G3′; ITS4： 5′TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3′[5]; 28S rRNA D1/D2區(qū)域引物：NL1：5′GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG3′; NL4：5′GGT CCG TGT TTC AAG ACG G3′[7]。

PCR 反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 1.0 μL（20 ng/μL）、上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L）、2×Es Taq Master Mix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）10.0 μL、ddH2O 7.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，ITS 48℃退火30 s，D1/D2 50℃退火30 s，72℃延伸40 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，獲得清晰的單一預(yù)期條帶后直接送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將所得序列在NCBI的GenBank中與已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑白粉病的癥狀

桑里白粉病發(fā)病初期葉背產(chǎn)生白色近圓形或不規(guī)則形的小粉斑，后向四周擴(kuò)展成邊緣不明顯的白色斑片，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)葉片背面布滿白粉，即病原菌無性階段的分生孢子，在白斑相應(yīng)的桑葉正面可見淡黃褐色病斑。在南寧市，12月初，病斑上產(chǎn)生黃褐色和黑色小顆粒，為病原菌有性階段的閉囊殼（圖1）。

2.2 桑里白粉病菌的形態(tài)特征

分生孢子單生在菌絲頂端，棍棒狀，無色，大小為（55～85）μm×（20～30）μm。菌絲無色，細(xì)長(zhǎng)無分枝，頂端逐漸變粗，中間無隔膜，僅在頂端與分生孢子相連接處有2個(gè)相鄰的隔膜，隔膜相距30～50 μm，成熟的分生孢子從最頂端的隔膜處斷裂。菌絲體上有對(duì)生的附著胞，少數(shù)兩個(gè)附著胞生在一側(cè)，也有少數(shù)單生一個(gè)附著胞（圖3）。

2.3 桑表白粉病菌的形態(tài)特征

菌絲體透明，有分枝，有隔膜;分生孢子單生，由分生孢子梗頂端斷裂形成短圓柱形或橢圓形的分生孢子，無色或淡黃色;直徑50～70 μm（圖5）。

2.4 桑里白粉病菌ITS區(qū)域序列分析

用ITS1和ITS4引物對(duì)PCR擴(kuò)增出的ITS序列長(zhǎng)度為620 bp（圖7），經(jīng)過BLAST分析，與NCBI的GenBank中桑生球針殼P.moricola（AB080540.1）的同源性為99%，覆蓋率為99%。

2.5 桑表白粉病菌的ITS和28S rRNA D1/D2區(qū)域的PCR擴(kuò)增及序列分析

2.5.1 桑表白粉病菌ITS的PCR擴(kuò)增及序列分析

用ITS1/ITS4引物擴(kuò)增出桑表白粉菌的ITS序列長(zhǎng)度為622 bp（圖8），經(jīng)過BLAST分析，與NCBI的GenBank中的桑白粉菌Erysiphe mori（KY910120.1）的同源性99%，覆蓋率96%。

2.5.2 桑表白粉病菌28S rRNA D1/D2區(qū)域PCR產(chǎn)物擴(kuò)增及序列分析

3 結(jié)論與討論

白粉菌的傳統(tǒng)分類方法主要依據(jù)其寄主和有性世代閉囊殼內(nèi)子囊的個(gè)數(shù)及子囊孢子的數(shù)目來進(jìn)行的[8]。但近年來，隨著分子生物學(xué)和掃描電鏡技術(shù)在病原菌鑒定中的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的分類方法并不全面，有些有性世代相同，但無性態(tài)的分生孢子卻截然不同[9]。Braun把白粉菌屬分為三個(gè)組，即白粉菌屬的白粉菌組Erysiphe sect. Erysiphe，戈洛文組Erysiphe sect. Golovinomyces和鼬瓣花白粉菌組Erysiphe sect. Galeopsidis。這三個(gè)組的無性型明顯不同，其中Erysiphe sect. Erysiphe組的在一天內(nèi)只產(chǎn)生一個(gè)分生孢子，為單生型（Pseudoidium型），分生孢子梗具有裂片狀附著器;其他兩個(gè)組的分生孢子均為串生的[10]。因此，將分生孢子單生的保留在白粉菌屬Erysiphe內(nèi)[12]，Gelyuta 1988年將串生的Erysiphe sect. Golovinomyces提升為屬，即戈洛文屬Golovinomyces （U. Braun）V.P.Gelyuta[10];以鼬瓣花白粉菌Erysiphe galeopsidis為模式種建立了一個(gè)新屬，定名為新白粉菌屬Neoerysiphe U. Braun[11]?，F(xiàn)在，該分類方法已被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可。狹義的白粉菌屬Erysiphe s. str.在形態(tài)上與鉤絲殼屬Uncinula十分接近，并通過一些中間類群彼此相連。鉤絲殼屬的種在假粉孢支系中構(gòu)成了基部的一個(gè)亞分支，包括大多數(shù)鉤絲殼屬的種和幾個(gè)狹義白粉菌屬的種[10]。因此Braun & Takamatsu將鉤絲殼屬作為白粉菌屬Erysiphe的異名[12]，桑鉤絲殼Uncinula mori作為原鉤絲殼屬中的一種，也應(yīng)該歸為白粉菌屬。

本文通過對(duì)病原菌的形態(tài)特征觀察和ITS、D1/D2基因的序列分析，明確了桑里白粉病的病原菌為桑生球針殼Phyllactinia moricola;桑表白粉病的病原菌為桑白粉菌Erysiphe mori，桑鉤絲殼Uncinula mori這個(gè)學(xué)名不再使用，是桑白粉菌的異名。

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（責(zé)任編輯：田 喆）