太子參環(huán)肽提取物對(duì)ＬＱＩＳ－ＣＯＰＤ大鼠動(dòng)物模型的干預(yù)作用

楊晗 闞永軍 曾潔

【摘要】目的：考察太子參環(huán)肽提取物對(duì)肺氣虛證慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的干預(yù)作用。方法：采用煙熏+木瓜酶蛋白制備肺氣虛證慢性阻塞性肺疾?。╟hronicobstructivepulmonarydiseaseoflung-qiinsufficiencysyndrome，LQIS-COPD）大鼠模型，太子參環(huán)肽提取物高、中、低劑量（100mg/kg/d、200mg/kg/d、400mg/kg/d），灌胃給藥30d;測(cè)定大鼠的氣道阻力和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性。結(jié)果：LQIS-COPD大鼠給予太子參環(huán)肽提取物治療后，咳嗽、氣急、喘鳴的癥狀明顯改善，顯著降低模型大鼠的肺氣道阻力，增加其肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性。結(jié)論：太子參環(huán)肽提取物對(duì)LQIS-COPD有良好的干預(yù)作用。

【關(guān)鍵詞】太子參;環(huán)肽提取物;LQIS-COPD;干預(yù)作用

【中圖分類號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）1-0025-03

慢性阻塞性肺疾?。–hronicObstructivePulmonanyDisease，COPD），是以氣道不完全可逆性氣流受限為特征的疾病，與肺部對(duì)香煙、霧霾等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。COPD屬于中醫(yī)“喘證”、“肺脹”等范疇。病情長(zhǎng)期反復(fù)于緩解和急性發(fā)作之間，日益加重。中醫(yī)藥防治有悠久歷史，各醫(yī)家多以祛邪和補(bǔ)虛相結(jié)合的方法治療。急則治標(biāo)，急性發(fā)作期多以祛邪為主;緩則治本，穩(wěn)定期補(bǔ)虛，或攻補(bǔ)兼施。無論是在COPD急性期還是穩(wěn)定期，不僅止咳化痰平喘，還進(jìn)行全身整體調(diào)節(jié)，中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合均有著很好的療效，且副作用小[2-3]。

肺氣虛是COPD的始動(dòng)因素，并貫穿于整個(gè)病程。對(duì)氣虛的治療是COPD穩(wěn)定期的重要中醫(yī)治療策略[4];肺氣虛的改善，可以有效減輕癥狀和減緩肺功能下降趨勢(shì)，對(duì)于多發(fā)、難治、具有反復(fù)發(fā)作特點(diǎn)的肺系疾病的綜合防治有積極作用[5]。太子參為石竹科植物孩兒參（Pseudostellariaheterophylla（Miq.）PaxexPaxetHoffm.）的塊根。既能益氣，又可養(yǎng)陰，適用于脾肺虧虛氣陰不足者。以清補(bǔ)潤(rùn)燥見長(zhǎng)，在中醫(yī)治療慢性呼吸系統(tǒng)疾病中，為治療肺氣虛的核心藥物，使用頻次很高[6]。

太子參中所含化學(xué)成分種類繁多。其中，太子參環(huán)肽是由十多個(gè)氨基酸脫水縮合形成的環(huán)狀化合物，不僅具有能夠形成限制性構(gòu)像的特點(diǎn)，而且其抗化學(xué)降解和抗酶解的能力在生物體內(nèi)也強(qiáng)于線性肽，是一類有特色化學(xué)結(jié)構(gòu)的成分[7]，但活性并不明確。制備液相色譜能夠?qū)崿F(xiàn)在線檢測(cè)，具有高效分離的特點(diǎn)，其自動(dòng)化的程度比較高，操作簡(jiǎn)單，所得產(chǎn)品純度較高，在中藥制備分離方面得到了廣泛的應(yīng)用[8]。本文利用制備型高效液相制備分離環(huán)肽提取物，從肺氣虛證（Lung-qiInsufficiencySyndrome，LQIS）入手，探討太子參環(huán)肽提取物對(duì)COPD的干預(yù)作用，以活性為導(dǎo)向，發(fā)現(xiàn)太子參中藥效物質(zhì)。

1儀器與材料

1.1儀器ShimazuLC-8A型制備液相色譜儀（Japan），Waterse2695液相色譜儀，HypersilBDSC18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱、C18制備型液相色譜柱;Medlab生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（南京美易有限公司），超聲霧化器（廣東粵華醫(yī)療器械有限公司），生理體積描記盒（南京美易科技有限公司），呼吸流量計(jì)（北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司）;MOKULYOD-230型冷凍干燥器;BARNSTEADTⅡ型超純水機(jī)（美國(guó)Thermo公司）。

1.2材料太子參[Pseudostellariaheterophylla（Miq.）PaxexPaxetHoffm.]，購(gòu)于福建柘參種業(yè)有限公司，經(jīng)檢驗(yàn)符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司出品。

色譜純?cè)噭杭状迹ǖ聡?guó)Merck公司），乙腈（美國(guó)Fisher公司）;分析純?cè)噭┚鶠閲?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司出品，水為電阻率為18.2Ω的超純水。

2方法結(jié)果

2.1太子參環(huán)肽提取物制備稱取干燥一定重量的太子參藥材粉碎至20目，以10倍乙酸乙酯為溶劑，采用索氏提取法提取2次，每次3h，過濾合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓回收乙酸乙酯，獲得干浸膏。取太子參乙酸乙酯干浸膏，以甲醇溶解，按本項(xiàng)目組專利方法進(jìn)行高壓制備色譜環(huán)肽提取物分離，采用制備型液相色譜柱、采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm;以乙腈—磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，自動(dòng)餾分收集器收集餾分[9]。按如下方法檢視提取物特征。

2.2環(huán)肽的檢識(shí)

2.2.1薄層鑒別按文獻(xiàn)方法[10]，取兩塊25mm×50mm的硅膠板G（板1和板2），將樣品分別點(diǎn)在兩塊板上，用氯仿-甲醇（9∶[KG-*3/5]1）展開揮掉溶劑后，板1放置，而板2懸于底部加有約1mL濃鹽酸的密閉的磨口玻璃缸中（耐酸和耐高溫玻璃缸），置于已升溫至110℃的烘箱中，加熱水解1～2h，冷卻后取出板2，在通風(fēng)柜中揮掉鹽酸然后將未經(jīng)水解的板1和加熱酸水解的板2同時(shí)噴灑0.2%茚三酮丙酮試劑，用電吹風(fēng)加熱幾分鐘即可顯色。用上述方法重復(fù)操作一次，根據(jù)兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，板2在多數(shù)情況下顯示幾個(gè)紫紅色斑點(diǎn)，少數(shù)情況下顯示某些黃色斑點(diǎn)，而板1在相應(yīng)位置上無顯色斑點(diǎn)，由此提示樣品含有環(huán)肽或肽酰胺成分。

取50mm×50mm硅膠G板（板3），按照雙向薄層層析板點(diǎn)樣方法將樣品點(diǎn)在板上，用氯仿-甲醇（9∶[KG-*3/5]1）作第一向展開揮掉溶劑后，先按前述方法濃鹽酸高溫水解冷卻揮掉鹽酸后，然后在溶劑系統(tǒng)A（氯仿-甲醇-冰醋酸，8∶2∶2滴）進(jìn)行第二向展開。揮掉溶劑后，板3噴灑0.2%茚三酮丙酮試劑，用電吹風(fēng)加熱幾分鐘斑點(diǎn)即顯出，按照上述方法再重復(fù)操作一次，板3在第二向的同一軸上顯示多個(gè)紫紅色或黃色斑點(diǎn)，確定樣品中含有環(huán)肽成分。

2.2.2代表性環(huán)肽波譜數(shù)據(jù)太子參環(huán)肽A，[M+H]+m/z728.4346，分子式C37H57N7O8，摩爾質(zhì)量727.4269，二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）特征碎片離子m/z分別為728.4354、710.4245、610.2519、310.2149、197.1280;太子參環(huán)肽B，[M+H]+m/z779.4434，分子摩爾質(zhì)量778.4378，分子式C40H58N8O8，二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）特征碎片離子m/z分別為779.4467、751.4508、405.2494。

2.3藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1動(dòng)物造模本實(shí)驗(yàn)采用《中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》之“肺氣虛證”動(dòng)物模型制備方法，并復(fù)合木瓜蛋白酶霧化吸入，復(fù)制“LQIS-COPD”模型大鼠。正常組（空白對(duì)照）置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng);大鼠暴露于1m3煙室中，用刨花/鋸末30g，香煙每支燃約10min，連續(xù)3支;另加SO2粉10g，點(diǎn)燃煙熏;每日2次，每次1h，并于造模開始后第30、32、34、36天將超聲波霧化器與40cm×40cm×40cm透明塑料箱相連，通過霧化管向箱中模型大鼠噴入0.3%的木瓜蛋白酶，每5只大鼠2mL，造模期60d。

2.3.2分組給藥Wistar大鼠隨機(jī)分組，每組10只?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組造模結(jié)束后開始用生理鹽水灌胃10mL/kg·d，同時(shí)霧化吸入生理鹽水4mL/d;陽(yáng)性對(duì)照組，灌服桂龍咳喘膠囊：每天用藥劑量1.25mL/100g，以含生藥0.09g/mL的藥液灌服;治療組，太子參環(huán)肽提取物高、中、低劑量（100mg/kg/d、200mg/kg/d、400mg/kg/d），灌胃給藥模型大鼠30d。

2.3.3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS15.0軟件，數(shù)據(jù)以均值（x±s）的形式表示，二組間的比較用t檢驗(yàn)，二個(gè)以上組間的比較用ANOVA/Holm-Sidak統(tǒng)計(jì)軟件處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1模型大鼠一般狀況大鼠出現(xiàn)咳嗽、氣急、喘鳴、精神萎靡、行動(dòng)遲緩、蜷伏不動(dòng)、毛失光澤等癥狀，檢測(cè)一秒用力呼氣容積（FEV1）和用力呼氣量（FEV），F(xiàn)EV1/FVC<70%、30%

2.4.2大鼠肺功能測(cè)試灌胃給藥結(jié)束第2天，以25%烏拉坦（4mL/kg相當(dāng)于1000mg/kg）將大鼠麻醉后，切開頸部皮膚，分離氣管，行氣管插管。壓力換能器、呼吸流量計(jì)連接Medlab生物信號(hào)系統(tǒng)測(cè)出潮氣量、氣道流速、跨肺壓，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得到肺氣道阻力（RL）和動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性（Cdyn）。LQIS-COPD大鼠給予太子參環(huán)肽提取物治療后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

3結(jié)論

LQIS-COPD大鼠給予太子參環(huán)肽提取物治療后，LQIS-COPD大鼠咳嗽、氣急、喘鳴的癥狀明顯改善。

模型組大鼠RL較空白對(duì)照組增加了40.10%，而Cdyn則下降了75.14%;桂龍咳喘膠囊陽(yáng)性對(duì)照組，較模型組RL下降了25.99%，Cdyn增加了140.40%。太子參環(huán)肽提取物400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg低、中、高劑量組，RL分別下降了24.01%、25.25%、26.98%，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05～0.01）;而Cdyn則分別增加了168.98%、170.83%%、171.30%，與模型組比差異較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。結(jié)果表明太子參環(huán)肽提取物高中低劑量均能明顯降低LQIS-COPD大鼠的肺氣道阻力，而顯著增加其肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性，太子參環(huán)肽提取物對(duì)肺氣虛證慢性阻塞性肺疾病模型大鼠具有良好的干預(yù)作用。

4討論

COPD是一種常見疾病，吸煙或被動(dòng)吸煙是引發(fā)該疾病十分重要的因素。氣道阻力及氣流受限是COPD的發(fā)展進(jìn)程中的主要特征，氣道阻力的增加會(huì)導(dǎo)致肺內(nèi)殘留氣體過多，從而引發(fā)肺和胸廓的順應(yīng)性下降及呼吸功能障礙。本研究采用了RL及Cdyn兩個(gè)指標(biāo)，判定太子參環(huán)肽提取物對(duì)LQIS-COPD的干預(yù)作用，其中RL反映了大鼠大氣道的氣流阻力情況，而Cdyn則反映了大鼠小氣道的氣流阻力及胸廓和肺組織的彈性狀況。研究結(jié)果顯示，太子參環(huán)肽提取物對(duì)煙熏+木瓜酶蛋白造模所產(chǎn)生的氣道阻力升高及肺部動(dòng)態(tài)順應(yīng)性降低具有顯著的抑制作用，從而證明了太子參環(huán)肽提取物對(duì)肺氣虛證LQIS-COPD模型大鼠的干預(yù)作用。

COPD疾病易長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，且久病難以治愈，從而損傷肺氣。肺主氣，司呼吸，控制一身之氣生成，肺氣虛損則肺失治節(jié)，則氣機(jī)不暢，宗氣不足，營(yíng)衛(wèi)功能失調(diào)，從而外邪入侵，痞滿壅肺，引發(fā)咳嗽、肺脹、氣喘等現(xiàn)象。太子參補(bǔ)益肺氣具有潤(rùn)肺止咳之功效，本文從肺氣虛證入手，探討太子參益氣養(yǎng)陰的藥理作用;以活性為導(dǎo)向，探索環(huán)肽類特色物質(zhì)在太子參中所擔(dān)當(dāng)?shù)摹盎钚越巧?，?duì)于進(jìn)一步研究太子參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]LiuSF，TsengCW，TuML，etal.TheclinicalCOPDquestionnairecorrelatedwithBODEindex-Across-sectionalstudy[J].ScientificWorldJournal，2012，2012：361535.

[2]余學(xué)慶，李建生，李力.慢性阻塞性肺疾?。–OPD）中醫(yī)證候分布規(guī)律研究[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，18（4）：44-46.

[3]鐘相根，李宇航，祝小惠.慢性阻塞性肺疾病氣道黏液高分泌機(jī)制及中醫(yī)藥干預(yù)作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（8）：1686-1689.

[4]李澤庚，楊程，彭波，等.慢性阻塞性肺病肺氣虛證和肺陰虛證患者細(xì)胞因子變化的研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（6）：24-25.

[5]張雙勝，胡紫光，馮鳳芳.益氣活血納腎方對(duì)慢性阻塞性肺病穩(wěn)定期患者BODE指數(shù)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（4）：38-39.

[6]李譜智.中醫(yī)藥防治小兒反復(fù)呼吸道感染近況.河北中醫(yī)[J]，1998，20（6）：383-385.

[7]馬迎莉，王曉容，鄒慧超，等.藥用植物太子參化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，43（5）：827-833.

[8]王欣然，齊建平，吳夏青，等.制備型高效液相色譜在藥物分離純化中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].分析試驗(yàn)室，2014，33（12）：1476-1480.

[9]龐文生，胡娟，白少偉，等.太子參環(huán)肽類提取物及在制備治療COPD藥物中的應(yīng)用[P].中國(guó)，2016-05-11.

[10]周俊，譚寧華.植物環(huán)肽的薄層化學(xué)識(shí)別新方法及其在植物化學(xué)研究中的應(yīng)用[J].科學(xué)通報(bào)，2000，45（10）：1047-1051.

[11]張葵，滕久祥，彭芝配.肺氣虛證穩(wěn)定期慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（3）：179-181.