紅心火龍果柚子復(fù)合果醋發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

熊亞，李敏杰*

(1.攀枝花學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花市 干熱河谷特色生物資源工程技術(shù)中心，四川 攀枝花 617000)

與糧食醋相比，果醋的營養(yǎng)成分更為豐富，且口味醇厚、風(fēng)味濃郁、新鮮爽口、功效獨(dú)特。果醋因其良好的飲用風(fēng)味與營養(yǎng)保健功能，已受到越來越多消費(fèi)者的歡迎，人們對(duì)果醋的營養(yǎng)、口感、風(fēng)味的要求日益俱增[1-3]。目前雖然果醋的品種開始增多，也不斷有各種復(fù)合醋研制的報(bào)道[4-6]，但果醋市場(chǎng)的品種及口味還比較單一，復(fù)合型醋飲料及調(diào)味品仍具有很大的市場(chǎng)潛力。

紅心火龍果和柚子都是很好的食用資源，火龍果除了是一種高纖維、低脂肪、低糖度的水果外，還含有碳水化合物、粗纖維、不飽和脂肪酸、抗氧化物、VC和花青素等，甚至還含有其他植物少有的植物性蛋白，對(duì)人體重金屬中毒具有解毒的功效[7]。柚子含多種糖類、有機(jī)酸、維生素和各種無機(jī)鹽，對(duì)人體十分有益[8]，柚子果肉及皮含有生物活性物質(zhì)生物苷[9]，可以降低血液粘稠度，對(duì)腦血管疾病如腦血栓、腦卒等有較好的預(yù)防作用[10]。目前對(duì)它們的利用主要集中在果汁飲料、果酒、單一果醋的發(fā)酵方面[11-16]，對(duì)紅心火龍果柚子復(fù)合醋的研制尚未見相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法，對(duì)紅心火龍果柚子復(fù)合醋的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為開發(fā)復(fù)合醋市場(chǎng)潛力、綜合資源利用等提供一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

坪山柚、紅心火龍果：購于沃爾瑪超市；酵母(安琪高活性酵母)：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；果醋菌：煙臺(tái)帝伯仕自釀?dòng)邢薰?；果膠酶(3×105U/g)：江蘇銳陽生物科技有限公司；亞硫酸(99.8%)、檸檬酸(AR)、NaOH(AR)：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-C恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱 江蘇省金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；FA2204B型電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；Q/GHSC型精密pH計(jì) 上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；WYT-J型手持式糖度儀 成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；D2KW-4型電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；0-40型酒精計(jì) 國營河北省武強(qiáng)縣儀表廠；T2264MD榨汁機(jī) 上海九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

紅心火龍果、柚子→洗凈、去皮、榨汁→以一定比例混合→酶解→過濾→SO2、果膠酶↓濾汁→成分調(diào)整↑酵母、白砂糖、檸檬酸→酒精發(fā)酵→酒精發(fā)酵液→加入醋酸菌→醋酸發(fā)酵→殺菌→成品。

1.3.2 操作要點(diǎn)

原料預(yù)處理：將紅心火龍果和柚子洗干凈，去掉果皮，柚子去核，然后將去皮紅心火龍果和柚子分別切成大小合適的小塊，放入榨汁機(jī)破碎榨汁。

SO2、果膠酶的添加：榨汁后加入60 mg/L的二氧化硫以防止雜菌污染，并加入50 mg/L果膠酶酶解1 h以分解果膠，增加出汁率。

成分調(diào)整：加入白砂糖調(diào)節(jié)初始糖度為220 g/L，加入檸檬酸調(diào)節(jié)酸度為4.5 g/L，加入酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵。

酒精發(fā)酵：按照試驗(yàn)方案調(diào)整好后，放置于恒溫培養(yǎng)箱(溫度按照試驗(yàn)方案進(jìn)行調(diào)整)中發(fā)酵8 d。

醋酸發(fā)酵：按照試驗(yàn)方案將酒精發(fā)酵液放置于恒溫?fù)u床(溫度按照試驗(yàn)方案進(jìn)行調(diào)整)中進(jìn)行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵10 d。

1.3.3 酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

試驗(yàn)選取溫度(22，24，26，28，30 ℃)、酵母菌接種量(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L)、紅心火龍果汁與柚子汁的體積混合比例(1∶1、2∶3、3∶7、1∶4、1∶9)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定紅心火龍果柚子酒的酒精度。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)。以最終產(chǎn)品的酒精度為指標(biāo)，得出紅心火龍果柚子酒的最佳發(fā)酵參數(shù)。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，利用正交助手V3.1軟件進(jìn)行方差分析。

1.3.4 醋酸發(fā)酵單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)

紅心火龍果柚子復(fù)合果醋的發(fā)酵是在生成紅心火龍果柚子復(fù)合果酒的基礎(chǔ)上，在有氧的條件下，利用果醋菌，將果酒轉(zhuǎn)化為果醋的過程。醋酸含量作為衡量產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。由大量資料查得，影響果醋發(fā)酵最大的因素分別為發(fā)酵溫度、初始酒精度和醋酸菌接種量。因此，選取發(fā)酵溫度(28，30，32，34，36 ℃)、果醋菌接種量(300，400，500，600，700 mg/L)、初始酒精度(4%、6%、8%、10%、12%)來進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，以初始酒精度(X1)、發(fā)酵溫度(X2)、醋酸菌接種量(X3)為自變量，以醋酸含量(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵工藝。

1.3.5 理化指標(biāo)的測(cè)定

酒精度的測(cè)定：采用蒸餾法對(duì)果酒的酒精度進(jìn)行測(cè)定；醋酸含量的測(cè)定：利用強(qiáng)堿滴定弱酸的中和滴定原理來進(jìn)行醋酸含量的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵單因素和正交試驗(yàn)

2.1.1 不同發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響

圖1 溫度對(duì)紅心火龍果柚子汁酒精度的影響Fig.1 The effect of temperature on alcohol degree of red pitaya and pomelo juice

由圖1可知，當(dāng)溫度低于26 ℃時(shí)，隨著溫度升高，酒精度升高；當(dāng)溫度高于26 ℃時(shí)，隨著溫度升高，酒精度降低；當(dāng)溫度為26 ℃時(shí)，酒精度最高，為4.2%。這可能是由于溫度影響了酵母菌的活性，溫度較低時(shí)，酵母菌的生長受到抑制；溫度較高時(shí)，酵母菌容易死亡。因此，選定紅心火龍果柚子汁酒精發(fā)酵的最佳溫度為26 ℃。

2.1.2 酵母菌接種量對(duì)酒精度的影響

由圖2可知，當(dāng)酵母菌接種量低于0.4 g/L時(shí)，隨著酵母菌接種量升高，酒精度升高；當(dāng)酵母菌接種量高于0.4 g/L時(shí)，隨著酵母菌接種量升高，酒精度降低；當(dāng)酵母菌接種量為0.4 g/L時(shí)，酒精度最高，為4.2%。這可能是由于發(fā)酵液的營養(yǎng)成分影響了酵母菌的活性，酵母菌接種量較低時(shí)，營養(yǎng)成分過剩，酵母菌不能產(chǎn)生更多酒精；酵母菌接種量較高時(shí)，營養(yǎng)成分有限，反而抑制了酵母菌產(chǎn)生酒精。因此，選定紅心火龍果柚子汁酒精發(fā)酵的最佳酵母菌接種量為0.4 g/L。

圖2 酵母菌接種量對(duì)酒精度的影響Fig.2 The effect of inoculation amount of yeast on alcohol degree

2.1.3 紅心火龍果汁柚子汁混合比例對(duì)酒精度的影響

圖3 紅心火龍果汁和柚子汁混合比例對(duì)酒精度的影響Fig.3 The effect of the proportion of red pitaya juice and pomelo juice on alcohol degree

由圖3可知，當(dāng)2種水果果汁比例低于1∶4時(shí)，隨著柚子汁比例升高，酒精度升高；當(dāng)果汁比例高于1∶4時(shí)，隨著柚子汁比例升高，酒精度降低；當(dāng)果汁比例為1∶4時(shí)，酒精度最高，為4.2%。這可能是由于發(fā)酵液的糖含量影響了酵母菌的活性，紅心火龍果的甜度要高于柚子，如果紅心火龍果汁比例過高，糖含量較高時(shí)，過高的糖含量反而抑制了酵母菌產(chǎn)生酒精；糖含量較低時(shí)，也不利于酵母菌發(fā)酵，不能產(chǎn)生更多酒精；因此根據(jù)酒精度，選定紅心火龍果汁和柚子汁的最佳體積比例為1∶4。

2.1.4 紅心火龍果柚子復(fù)合醋酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)

表1 紅心火龍果柚子復(fù)合醋酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The design of orthogonal experiment for alcoholic fermentation of red pitaya and pomelo compound vinegar

表2 紅心火龍果柚子復(fù)合醋酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results of alcoholic fermentation of red pitaya and pomelo compound vinegar

表3 紅心火龍果柚子復(fù)合醋酒精發(fā)酵 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal experimental results of alcoholic fermentation of red pitaya and pomelo compound vinegar

由表2可知RC>RA>RB，即紅心火龍果汁與柚子汁的混合比例對(duì)紅心火龍果柚子復(fù)合醋的酒精度影響最大，其次是溫度，酵母菌接種量的影響最小，最優(yōu)組合是A2B2C1，即溫度為26 ℃，酵母菌接種量為0.4 g/L，紅心火龍果汁與柚子汁的混合比例為3∶7。由表3可知，各因素的F比都小于F臨界值，各因素的影響均不顯著。

2.2 醋酸發(fā)酵單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)醋酸含量的影響

由圖4可知，在初始酒精度為8%、果醋菌接種量為500 mg/L、搖床培養(yǎng)1周后，當(dāng)發(fā)酵溫度在34 ℃以下時(shí)，醋酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸上升，從32 ℃開始，上升幅度明顯增大。發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí)醋酸含量達(dá)到最高，為0.278 mol/L，溫度超過34 ℃以后，醋酸含量隨發(fā)酵溫度的升高不斷降低。溫度對(duì)醋酸菌的生長影響較大，溫度過低，醋酸菌生長緩慢，發(fā)酵周期延長，所以較低溫度范圍內(nèi)，醋酸生成較為緩慢。但溫度過高反而會(huì)抑制微生物細(xì)胞內(nèi)某些酶的作用甚至使其喪失活性，加快了菌體老化，使發(fā)酵產(chǎn)酸降低。因此，選取34 ℃為紅心火龍果柚子復(fù)合醋發(fā)酵的最佳溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)醋酸含量的影響Fig.4 The effect of fermentation temperature on acetic acid content

2.2.2 果醋菌接種量對(duì)醋酸含量的影響

圖5 果醋菌接種量對(duì)醋酸含量的影響Fig.5 The effect of inoculation amount of acetic acid bacteria on acetic acid content

由圖5可知，在發(fā)酵溫度為34 ℃、初始酒精度為8%、搖床培養(yǎng)1周后，醋酸含量隨果醋菌接種量的增加而增加，在果醋菌接種量為600 mg/L時(shí)達(dá)到最高，為0.341 mol/L，之后則隨著接種量的增加而下降。接種量在一定范圍內(nèi)，較高的接種量有利于提高醋酸的產(chǎn)量，但如果接種量過大，由于醋酸菌的生長本身也會(huì)消耗掉發(fā)酵液中大量的營養(yǎng)物質(zhì)，造成營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，醋酸形成不足。因此，選取600 mg/L為果醋菌的最佳接種量。

2.2.3 初始酒精度對(duì)醋酸含量的影響

由圖6可知，在發(fā)酵溫度為34 ℃、醋酸菌接種量為600 mg/L、搖床培養(yǎng)1周后，初始酒精度在10%以下時(shí)，醋酸含量隨著初始酒精度的升高不斷上升，初始酒精度為10%時(shí)達(dá)到最高，為0.146 mol/L。當(dāng)初始酒精度大于10%之后，醋酸含量開始下降。酒精是醋酸菌進(jìn)行繁殖代謝的主要營養(yǎng)物質(zhì)，在醋酸發(fā)酵過程中，醋酸菌利用乙醇將其氧化成為醋酸和水。在一定范圍內(nèi)，提高發(fā)酵液中的初始酒精度，可以提高醋酸發(fā)酵過程的產(chǎn)酸量，但是過高的酒精濃度也會(huì)對(duì)醋酸菌的生長和代謝產(chǎn)生抑制作用。因此，選取初始酒精度10%為紅心火龍果柚子復(fù)合果醋發(fā)酵的最佳條件。

圖6 初始酒精度對(duì)醋酸含量的影響Fig.6 The effect of initial alcohol degree on acetic acid content

2.2.4 紅心火龍果柚子復(fù)合醋醋酸發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表4和表5。

表4 響應(yīng)面分析因素及水平Table 4 The factors and levels of RSA

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The scheme and results of RSA

表6 回歸分析結(jié)果Table 6 The results of regression analysis

續(xù) 表

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

由表6可知，模型的P<0.0001<0.01，表明模型方程極顯著，說明試驗(yàn)方法可行可靠；失擬項(xiàng)P=0.1745>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明回歸方程的擬合度較好，能很好地反映工藝中各種因素和酸度(Y)之間的準(zhǔn)確關(guān)系，能夠利用回歸方程式得出最優(yōu)的工藝條件；模型的回歸決定系數(shù)R2=0.9751，表明有97.51%的響應(yīng)值變化是因?yàn)樗x擇的因素。X2對(duì)Y有顯著影響，是正效應(yīng)且極顯著；交互項(xiàng)X1X2、X2X3對(duì)Y有顯著影響，都為負(fù)效應(yīng)，X1X2影響極顯著；二次項(xiàng)X12、X22、X32也對(duì)Y有顯著影響，都為負(fù)效應(yīng)且影響極顯著，其余的變量影響都不顯著(P>0.05)。

經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=1.2-0.049X1+0.2X2-0.039X3-0.19X1X2-0.043X1X3-0.09X2X3-0.26X12-0.32X22-0.17X32。

對(duì)X1、X2、X3做如下變化：X1=(A-10)/2；X2=(B-34)/2；X3=(C-600)/100。

對(duì)回歸方程的各個(gè)因素求二階方程并計(jì)算，結(jié)果如下：X1=-1.38；X2=0.74；X3=-0.136。

把X1、X2、X3帶入到變換的式子中，得到A，B，C分別等于7.24、35.48、586.4。即紅心火龍果柚子復(fù)合果醋發(fā)酵工藝的最適初始酒精度、發(fā)酵溫度、果醋菌接種量分別為7.24%、35.48 ℃、586.4 mg/L。響應(yīng)值Y(酸度)為0.94 mol/L。

2.2.5 紅心火龍果柚子復(fù)合果醋的工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面圖及等高線圖

響應(yīng)面分析及等高線圖見圖7～圖9(圖7～圖9中的A，B，C分別代表X1、X2、X3)。

圖7 Y=f(X1，X2)的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour of Y=f(X1,X2)

注：Y表示響應(yīng)值酸度(mol/L)，X1表示初始酒精度(%)，X2表示發(fā)酵溫度(℃)。

圖8 Y=f(X1，X3)的響應(yīng)面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour of Y=f(X1,X3)

注：Y表示響應(yīng)值酸度(mol/L)，X1表示初始酒精度(%)，X3表示果醋菌接種量(mg/L)。

圖9 Y=f(X2，X3)的響應(yīng)面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour of Y=f(X2,X3)

注：Y表示響應(yīng)值酸度(mol/L)，X2表示發(fā)酵溫度(℃)，X3表示果醋菌接種量(mg/L)。

圖7顯示響應(yīng)面的坡度較陡，酸度受發(fā)酵溫度和初始酒精度的影響較大；酸度隨著發(fā)酵溫度和初始酒精度的增加，呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。從等高線密度來看，發(fā)酵溫度軸向等高線密度相對(duì)較大，表明發(fā)酵溫度對(duì)醋酸含量的影響比初始酒精度大。此外，等高線圖中的橢圓度較大，表明發(fā)酵溫度和初始酒精度兩因素的交互作用較強(qiáng)，對(duì)酸度的影響顯著。圖8顯示響應(yīng)面的坡度較陡，表明酸度受接種量和初始酒精度的影響較大；酸度隨著接種量和初始酒精度的增加，呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。等高線圖表明兩因素軸向等高線密度相差不大，即初始酒精度和接種量對(duì)酸度的影響大致相同。圖9顯示響應(yīng)面的坡度較陡，酸度受接種量和發(fā)酵溫度的影響較大；酸度隨接種量和發(fā)酵溫度的增加，呈先增加后減小的趨勢(shì)。從等高線密度可以看出，發(fā)酵溫度軸向等高線密度相對(duì)較大，表明發(fā)酵溫度對(duì)酸度的影響比接種量的影響大，發(fā)酵溫度和接種量兩因素的交互作用較強(qiáng)，對(duì)酸度的影響顯著。

2.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的正確性，根據(jù)實(shí)際情況對(duì)通過響應(yīng)面試驗(yàn)獲得的最佳發(fā)酵工藝條件進(jìn)行修正，修正為初始酒精度7%、發(fā)酵溫度35 ℃、果醋菌接種量586 mg/L，在此發(fā)酵工藝條件下重復(fù)紅心火龍果柚子復(fù)合果醋發(fā)酵3次，測(cè)得平均酸度為0.98 mol/L，與預(yù)測(cè)值0.94 mol/L相對(duì)誤差只有0.04%，可見模型能很好地預(yù)測(cè)紅心火龍果柚子復(fù)合果醋發(fā)酵的實(shí)際情況，即基于響應(yīng)面法優(yōu)化的紅心火龍果柚子復(fù)合果醋的發(fā)酵參數(shù)是比較可靠的。

3 結(jié)論

利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法獲得紅心火龍果柚子復(fù)合果醋的最佳工藝條件為初始酒精度7.24%、發(fā)酵溫度35.48 ℃、果醋菌接種量572.4 mg/L，由回歸方程可得出在此條件下紅心火龍果柚子復(fù)合果醋發(fā)酵的酸度理論值為0.94 mol/L。根據(jù)實(shí)際情況修正各因素值得到最優(yōu)的因素條件為初始酒精度7%、發(fā)酵溫度35 ℃、醋酸菌接種量586 mg/L，通過驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵后復(fù)合果醋平均酸度為0.98 mol/L。紅心火龍果柚子復(fù)合果醋呈暗紅色、澄清透明、無雜質(zhì)、無沉淀，具有火龍果和柚子的果香，酸甜適口，稍帶柚子的澀味，風(fēng)味協(xié)調(diào)。近年來，我國紅心火龍果和柚子的種植高速發(fā)展，鮮果市場(chǎng)逐漸趨于飽和或過飽和狀態(tài)。隨著近年來人們生活水平不斷提高，對(duì)食品的要求也越來越高，追求健康性和養(yǎng)生性。通過復(fù)合果醋的研制，為紅心火龍果、柚子資源的開發(fā)和市場(chǎng)深加工，以及新型富營養(yǎng)果醋品種的開發(fā)提供了理論依據(jù)。