圈養(yǎng)丹頂鶴血變原蟲的流行調(diào)查研究

賈 婷,鄭常明,丁 楠,楊明海,趙素芬,林寶慶,張顯光,羅 毅,張成林,索 勛

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;2.北京動物園圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點實驗室,北京 西城 100044;3.吉林向海國家級自然保護(hù)區(qū)管理局,吉林 通榆 137215;4.黑龍江扎龍國家級自然保護(hù)區(qū)管理局,黑龍江 齊齊哈爾 161002)

鳥類血孢子蟲(Haemosporidia)包括瘧原蟲、血變原蟲、住白細(xì)胞原蟲,分布廣泛,是感染鳥類的主要病原之一,威脅圈養(yǎng)和野生鳥類的健康[1-3]。小型野生鳥類,尤其是雀形目野生鳥類,因可以通過簡單的網(wǎng)捕法捕獲,所以其血孢子蟲研究取樣相對容易[1],對于大型鳥類,特別是受保護(hù)的物種,因采樣困難導(dǎo)致其血孢子蟲研究非常有限,在MalAvi數(shù)據(jù)庫中可用的未鑒定物種的血孢子蟲僅約100個記錄[4]。在動物園和救護(hù)中心對鳥類的檢查提供了關(guān)于大型受保護(hù)鳥類血孢子蟲的有價值信息[5]。Scott發(fā)表了關(guān)于倫敦動物園鳥類中由血孢子蟲引起嚴(yán)重疾病的第一個信息[6],在亞洲、歐洲、南美洲、北美洲和非洲的許多動物園都報道了嚴(yán)重的血孢子蟲病[7-11]。研究表明,在動物園的鳥類中瘧疾和其他血孢子蟲存在潛在流行病學(xué)風(fēng)險[10-13]。鶴(Gruiformes)被稱為濕地生態(tài)系統(tǒng)健康評估的“標(biāo)志物種”[14]。由于大多數(shù)的鶴科鳥類都是瀕危和受保護(hù)物種[15],許多國家都建立了遷地保護(hù)項目,以保護(hù)這些鳥類的種群數(shù)量,并支持生物多樣性保護(hù)。在圈養(yǎng)鶴中,血孢子蟲感染的報道較少[16-18],然而這些血孢子蟲可能是成功實施遷地保護(hù)項目的障礙[12]。

據(jù)統(tǒng)計,在中國鶴類中血孢子蟲引起的疾病高達(dá)26.15%,尤其是幼鶴感染后影響較大,致死率較高,是造成圈養(yǎng)鶴大批死亡的主要疾病之一[17-18],目前,血變原蟲引起鶴類發(fā)病的研究還未見報道。本研究分別采集北京動物園、扎龍國家級自然保護(hù)區(qū)和向海國家級自然保護(hù)區(qū)等地丹頂鶴、其他水禽、昆蟲等動物的血液和蟲體樣品,采用基因測序方法,檢測樣品中血變原蟲的感染情況,分析動物和傳播媒介之間可能存在的關(guān)系,為建立珍稀鳥類疫病防控體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品采集

1.1.1 采集地點 黑龍江扎龍國家級自然保護(hù)區(qū)、吉林向海國家級自然保護(hù)區(qū)、北京動物園(以下依次簡稱扎龍、向海、北京)。

1.1.2 樣品種類及數(shù)量 丹頂鶴樣品81份、水禽37種245份樣品、昆蟲3918只(見表1、表2、表3)。

1.1.3 采集時間 丹頂鶴血液、昆蟲樣品采集于2014年夏季;非丹頂鶴動物和北京動物園外鳥類樣品為近幾年積累采集。

1.2 樣品保存

1.2.1 血液樣品 新鮮血液分為3份,1份進(jìn)行血涂片染色鏡檢,1份置于抗凝管-80℃保存,1份置于專用樣品保存液,備用。

1.2.2 組織樣品 對于病死鶴等動物,剖檢后立即取肝、脾、肺、腎等臟器,分為2份,1份-80℃凍存,1份置于專用樣品保存液中,備用。

1.2.3 昆蟲樣品 用捕蚊網(wǎng)等工具采伊蚊、庫蚊、蚋、蠓,保存于專用樣品保存液中,備用。

表1 丹頂鶴樣品采集

表2 非丹頂鶴動物樣品

表3 昆蟲樣品

2 方法

2.1 血涂片檢測 取鶴類附跖靜脈血5 μL,滴加于載玻片制備血涂片。甲醇固定,瑞氏姬姆薩染液染色30 min后,流水沖洗,風(fēng)干后在光學(xué)顯微鏡下觀察。先在400×鏡頭下找到目標(biāo)位置,再用1 000×油鏡目視檢測,判斷個體是否感染血孢子蟲以及寄生蟲的形態(tài)特征,判斷其所屬類群,每個血涂片觀察100個視野[1]。

2.2 DNA提取和基因測序

2.2.1 基因組DNA提取 依照TIANGEN試劑盒的使用說明書進(jìn)行血液及昆蟲樣品DNA提取。

2.2.2 基因組DNA電泳檢測 取3 μL基因組DNA溶液,加入3 μL 2× Loading Buffer,充分混勻,1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測,凝膠用SYBR Green 1核酸凝膠染液染色,凝膠成像儀(GDS-8000PC,GENE,美國)中觀察,主條帶清晰者進(jìn)行下一步研究。

2.2.3 蚊子COI基因片段擴(kuò)增與測序 為準(zhǔn)確鑒定所采集蚊子等昆蟲的種類,選擇物種鑒定通用的條碼基因COI對昆蟲樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19]。所采用的引物為：C1J_1718(5′-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3′) 和 C1N_2191(5′-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3′)。 蚊子 COI基因片段擴(kuò)增體系：2×Tap酶混合溶液5 μL,引物C1J_1718、C1N_2191 各 0.2 μL,ddH2O 4 μL,模版 DNA 6 μL。蚊子COI基因片段擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置：Stage 1：95℃變性4 min;Stage 2：95℃變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸45 s(20個循環(huán));Stage 3：95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸45 s(15個循環(huán));Stage 4：72℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,凝膠用SYBR Green 1核酸凝膠染液染色,凝膠成像儀(GDS-8000PC,GENE,美國)中觀察。電泳檢測陽性者,配制40 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。

2.2.4 血液寄生蟲cyt b基因片段擴(kuò)增與測序 采用巢式PCR法,擴(kuò)增鳥類血液寄生蟲cyt b基因片段[20]。第一輪擴(kuò)增引物為HeamNF1(5′-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3′) 和 HeamNR3(5′-ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3′)。 血 液 寄 生 蟲cyt b基因片段擴(kuò)增第一輪的10 μL體系體系包括：2×Tap酶混合溶液 5 μL,HeamNF1、HeamNR3 各0.2 μL,ddH2O 4 μL,模版 DNA 0.6 μL。 血液寄生蟲cyt b基因片段擴(kuò)增第一輪反應(yīng)程序設(shè)置：Stage 1：94℃模版變性5 min;Stage 2：94℃產(chǎn)物變性30 s,50℃退火30 s,72℃引物延伸45 s(20個循環(huán));Stage 3：72℃延伸10 min。第二輪擴(kuò)增引物為HeamF(5′-ATGGTGTTTTAGATACTTACATT-3′) 和HeamR2(5′-CATTATCTGGATGAGATAATGGIGC-3′)。 反應(yīng)體系同第一輪擴(kuò)增,只是模板為第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物。血液寄生蟲cyt b基因片段擴(kuò)增第二輪反應(yīng)程序設(shè)置：Stage 1：94℃模版變性5 min;Stage 2：94℃產(chǎn)物變性30 s,50℃退火30 s,72℃引物延伸45 s(35個循環(huán));Stage 3：72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,凝膠用SYBR Green 1核酸凝膠染液染色,在凝膠成像儀(GDS-8000PC,GENE,美國)中觀察結(jié)果。電泳檢測為陽性的樣品,以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模版,配制40 μL反應(yīng)體系進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。所有樣品均重復(fù)檢測3次。

2.3 測序結(jié)果分析方法 分別計算中間寄主和非鶴類鳥類血液寄生蟲的感染率;用CodonCode Aligner(Copyright,美國)對cyt b基因的雙向測序結(jié)果進(jìn)行拼接,通過MalAvi數(shù)據(jù)庫(Version 2.1.1)中的Blast模塊進(jìn)行序列比對,確定血液寄生蟲所屬類群[6]。DNA序列相似度達(dá)到100%的歸為相同進(jìn)化支。

2.4 血液寄生蟲系統(tǒng)發(fā)育分析方法 選取Gen-Bank中血孢子蟲目各科屬已有序列和本研究測得的序列,共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù) Outlaw和Ricklefs(2014)構(gòu)建的血孢子蟲目系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[21],選擇小型哺乳動物的血液寄生蟲肝囊蟲(Hepatocystis.sp)作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外群。用DNASP v.5.10.1計算序列的單倍型數(shù)目(Haplotype number)等參數(shù)[22]。用jModelTest-v2.1.4進(jìn)行堿基替代模型檢驗,根據(jù)貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)(Bayesian Information Criterion,BIC)選擇的單倍型樹最適模型均為TN93+I+G。用BEAST v 1.8.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23]。采用嚴(yán)格分子鐘,種群歷史動態(tài)參數(shù)選擇Yule模型,運行蒙特卡洛 -馬爾科夫鏈(Monte Carlo Markov,MCMC)5×108代,每5 000代保存一次樹。在Tracer v.1.5中檢查運行結(jié)果,ESS值均大于200,表明MCMC鏈的運行達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。利用TreeAnnotator v 1.7.5舍棄前2 000棵樹(burnin=2 000)后,搜索最大分支置信樹(Maximum Clade Credibility Tree,MCC Tree)。用FigTree v1.4.2打開所獲得的MCC樹,進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 丹頂鶴血變原蟲的形態(tài)學(xué)特征 向海、扎龍自然保護(hù)區(qū)血涂片觀察到多只丹頂鶴感染血變原蟲,形態(tài)特征如下(見中插彩版圖1)：血變原蟲配子體寄生在宿主細(xì)胞質(zhì)中,沿著受感染的紅細(xì)胞細(xì)胞核生長,并且明顯使宿主細(xì)胞核移位。未成熟配子體形態(tài)多不規(guī)則,日益增長的配子體通常不觸及紅細(xì)胞的核,因此,它會產(chǎn)生或多或少不太明顯的未填充空間,如配子體與宿主紅細(xì)胞核之間的一個“裂隙”(見中插彩版圖1,A、B、D),這種“裂縫”在完全發(fā)育的配子體中消失(見中插彩版圖1,C、E、F)。成熟配子體的外圍邊緣平滑,與紅細(xì)胞的細(xì)胞膜緊密相靠,包裹紅細(xì)胞細(xì)胞核生長,但不完全包裹,留有大約細(xì)胞核長度的空隙(見中插彩版圖1,F)。大配子(見中插彩版圖1,A、B、C)體原生質(zhì)顆粒狀,粗糙、藍(lán)染,核紅染,胞漿中有時會包含一些小液泡,色素顆粒隨機(jī)分散在細(xì)胞質(zhì)中,呈現(xiàn)圓形或橢圓形,平均直徑大小為0.5～1.0 μm。 小配子體(中插彩版圖 1,D、E、F)細(xì)胞質(zhì)均勻,胞漿以及胞核染色均較大配子體染色淺。

3.2 丹頂鶴血變原蟲的感染情況 在81份丹頂鶴樣品中,血變原蟲檢出率為19.75%,共檢測出兩個血變原蟲 Haemoproteus antigonis(hGRUJAP01)和Haemoproteus sp.(hGRUJAP02)進(jìn)化支,其中hGRUJAP01檢出15份,占檢出樣品的93.75%(15/16);hGRUJAP01與已知血變原蟲序列GRUAME01相似性達(dá)100%,見表4。

3.3 非丹頂鶴鳥類(水鳥)血變原蟲的感染情況在鴻雁等37種動物245份樣品中,鵜鶘(Pelecanus rufescens)的樣品中檢出1個血變原蟲hPELRUF01進(jìn)化支,陽性率為0.41%,詳見表4。

3.4 昆蟲攜帶的血變原蟲的情況 為了便于操作,把4種3 918只昆蟲樣品分成190份進(jìn)行檢測,其中2份檢出血變原蟲,陽性率為1.05%,在扎龍和向海的里海伊蚊(Ochlerotatus caspius)中都檢出血變原蟲(hOCHCAS01)進(jìn)化支。蚊子中所檢測出的血變原蟲hOCHCAS01進(jìn)化支與向海和扎龍丹頂鶴中所檢測出的進(jìn)化支hGRUJAP01和hGRUJAP02為近緣類群,見表4。

表4 丹頂鶴、水鳥、昆蟲樣品中血變原蟲檢查結(jié)果

3.5 感染血變原蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析 對丹頂鶴、鵜鶘、里海伊蚊中檢出的血變原蟲進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析(圖2)。本研究根據(jù)比對結(jié)果共定義了4個單倍型,形成了1個血變原蟲屬單系群。扎龍、向海的丹頂鶴單倍型hGRUJAP01,hGRUJAP02與北京動物園鵜鶘的血變原蟲單倍型hPELRUF01以及扎龍、向海環(huán)境里海伊蚊中檢測到的血變原蟲單倍型hOCHCAS01與同一個血變原蟲進(jìn)化支(GRUAME01)近緣,而與其他已報道的鳥類血變原蟲系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

4 討論

有關(guān)鶴科鳥類感染血孢子蟲的研究報道較少,僅有兩種血變原蟲(H.antigonis和H.balearicae)和一種住白細(xì)胞原蟲(L.grusi)感染鶴科鳥類的報道[1]。

血變原蟲 H.antigonis最早的報道始于印度[21],目前尚未有我國丹頂鶴、鵜鶘和里海伊蚊中血變原蟲的cyt b基因序列報道,本研究發(fā)現(xiàn)的鶴科鳥類感染H.antigonis在中國尚屬首次報道。我們在丹頂鶴的血涂片中發(fā)現(xiàn)大量的血變原蟲紅內(nèi)期配子體,與已報道的H.antigonis配子體形態(tài)相吻合[21]。本研究報道的血變原蟲cyt b DNA序列(445 bp,GenBank登陸號MG980617)與在美國發(fā)現(xiàn)的鶴的血變原蟲序列(616 bp,GenBank登陸號KX223873.1)[22]相吻合,因此我們推測本研究發(fā)現(xiàn)的血孢子蟲屬于H.antigonis。在幼鶴和成鶴中均發(fā)現(xiàn)有H.antigonis感染,表明在當(dāng)?shù)匕l(fā)生了血變原蟲傳播,幼鳥的血變原蟲感染可能來源于親鶴。

圖2 感染血變原蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

基于cytb基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明,在丹頂鶴、鵜鶘、里海伊蚊樣品中發(fā)現(xiàn)的血變原蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近,并形成一個相對獨立的單系群,這個單系群與其他已報道的鳥類血變原蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。Darriba等(2012)報道血變原蟲的傳播媒介為虱蠅,本研究與其流行地域不同,我們推測系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的原因可能為H.antigonis可以通過與其他血變原蟲傳播媒介不同的雙翅目昆蟲媒介進(jìn)行傳播,但這一假設(shè)需要進(jìn)一步的現(xiàn)場觀察和實驗研究來驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)在81份丹頂鶴樣品中,血變原蟲檢出率為19.75%,雖然丹頂鶴等鳥類動物中血變原蟲的感染率較高,但是感染血變原蟲的發(fā)病率很低。所以我們不能確定目前檢測出的血變原蟲對丹頂鶴及相關(guān)動物潛在的致病作用。因此,我們要加強(qiáng)對珍稀鳥類中血變原蟲以及其他血孢子蟲的監(jiān)測。

研究發(fā)現(xiàn),在扎龍、向海的丹頂鶴,扎龍、向海的里海伊蚊,北京的鵜鶘樣品中檢測中相同的血變原蟲進(jìn)化支(GRUAME01),并且該進(jìn)化支是感染率最高的進(jìn)化支,并與向海丹頂鶴檢出的血變原蟲(BAFLA02)相似。伊蚊不是血變原蟲傳播的媒介,血變原蟲能否在伊蚊體內(nèi)完成生活史,伊蚊能否傳播血變原蟲,還有待進(jìn)一步研究。但是在伊蚊中檢測到血變原蟲,也進(jìn)一步證實環(huán)境中有血變原蟲流行情況,我們推斷是伊蚊叮咬了感染血變原蟲的圈養(yǎng)鶴類或者其他鳥類而攜帶帶有血變原蟲的血液,進(jìn)而被檢測出。

綜上,疫病監(jiān)測是做好疫病防控的重要手段,特別是動物園、保護(hù)區(qū)的圈養(yǎng)動物與保護(hù)區(qū)瀕危野生動物之間由于傳播媒介的聯(lián)系存在著密切的關(guān)系,因此要加強(qiáng)單位和部門之間的協(xié)同意識,建立疫病防控體系,對野生動物及生態(tài)保護(hù)有積極的意義。