基于鎖式探針的熒光定量PCR技術(shù)快速檢測(cè)肉制品中鴨源性成分

滿 岳/王溪橋/周小平 甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心 甘肅 蘭州 730010

Nazariyah Yahaya馬來西亞伊斯蘭科技大學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，汝來 馬來西亞 71800

丁功濤 西北民族大學(xué)，甘肅 蘭州 730030

李 冰 甘肅省輕工研究院，甘肅 蘭州730000

肉類摻假是目前我國(guó)食品行業(yè)面臨的突出問題。由于鴨肉的紋理與羊肉和牛肉近似，一些不法商家以廉價(jià)的鴨肉冒充價(jià)格較高的羊肉或牛肉進(jìn)行銷售，甚至加入羊牛肉精、羊牛肉粉等增加香味來掩蓋摻假行為。肉類摻假行為不但嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者經(jīng)濟(jì)利益，還嚴(yán)重影響他們的身體健康[1，2]。因此，建立快速、有效、簡(jiǎn)易的鴨源成分檢測(cè)方法對(duì)于監(jiān)管部門高效抑制肉類摻假不法行為十分必要。

利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)檢測(cè)種屬特異性基因已經(jīng)成為食品中肉類成分鑒別的主要手段。PCR方法最早應(yīng)用于檢測(cè)飼料中的羊、牛源性成分[3]，現(xiàn)在也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鴨源性成分檢測(cè)。國(guó)內(nèi)目前應(yīng)用于鴨源性成分鑒定的PCR方法包括PCR法，熒光定量PCR法，多重實(shí)時(shí)熒光 PCR 法以及微滴數(shù)字PCR法[2，4-6]。用于檢測(cè)的種屬特異性基因通常采用線粒體DNA組（mitochondrial DNA， mtDNA）的基因，例如細(xì)胞色素b基因（Cytochrome B gene，Cytb）和16S 核糖體 RNA（16s rRNA）基因 16s rDNA[2，7]。

鎖式探針是一種由兩個(gè)末端和中間鏈接序列組成的單鏈寡核苷酸片段，兩個(gè)末端含有靶標(biāo)序列。在檢測(cè)時(shí)，當(dāng)兩個(gè)末端序列和與靶標(biāo)DNA高度互補(bǔ)時(shí)，兩個(gè)末端空間位置靠近，在連接酶作用下探針被連接成環(huán)狀，然后通過滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification， RCA）對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。鎖式探針檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，可與分子標(biāo)記、反向斑點(diǎn)雜交、熒光 PCR、 DNA 芯片等技術(shù)結(jié)合，應(yīng)用于細(xì)胞原位檢測(cè)、微生物、病原物檢測(cè)鑒定等[8-10]。不過鎖式探針在肉類成分檢測(cè)中的應(yīng)用尚未有報(bào)道。

本研究依據(jù)鴨源線粒體DNA組的16s rDNA基因特有序列設(shè)計(jì)特異性鎖式探針及擴(kuò)增引物，探討基于鎖式探針的實(shí)時(shí)熒光PCR在肉制品中鴨源性成分快速檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用效果，以期為肉類質(zhì)量監(jiān)控檢測(cè)提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品

蘭州市城關(guān)區(qū)大潤(rùn)發(fā)超市內(nèi)購買的鴨肉、豬肉，羊肉與牛肉用于本實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 試劑：

Probe Premix Ex Taq II購自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒購自上海捷瑞公司；核酸外切酶Ⅲ、核酸外切酶Ⅰ和Taq DNA連接酶均購自NEB公司。

1.3 儀器：

分析天平BT125D（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；控溫磁力攪拌器（金壇區(qū)醫(yī)療儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）；旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Real Time PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.4 鎖式探針設(shè)計(jì)：

鎖式探針、擴(kuò)增引物和熒光探針（表1）均由合創(chuàng)（廣州）生物科技有限公司合成。設(shè)計(jì)思路參照已發(fā)表文獻(xiàn)[11，12]。

表1 鎖式探針、擴(kuò)增引物與熒光探針列表

1.5 DNA提?。?/h3>

DNA步驟簡(jiǎn)述如下：（1）稱取50-200mg鴨肌肉組織到研缽中，立即用液氮研磨，并收集到離心管中。接著加入500uL裂解液和10uL蛋白酶K（20mg/ml），55℃水浴2h；（2）將上述處理好的樣本裂解液，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇混合液（25：24：1），12000rpm離心10min；（3）轉(zhuǎn)移上清液(約400uL)并加入等體積的無水乙醇和1/10體積的NaAc，顛倒混勻后轉(zhuǎn)移至離心柱中（分2次轉(zhuǎn)移），8000rpm 離心30s-60s，倒棄濾液；（4）將剩余的上清液轉(zhuǎn)移到離心柱中，8000rpm 離心30s-60s，倒棄濾液，加500uL 80%的無水乙醇， 8000rpm 離心30s-60s，接著重復(fù)上述操作一次；（5）倒棄濾液，將離心柱放回離心管中，12000rpm 離心 2min；（6）丟棄離心管，將Centrifugal column轉(zhuǎn)移到新的離心管中，室溫放置2min，揮發(fā)剩余的乙醇；（7）加30-50uL 洗脫液室溫靜置2min 或55℃溶解2min，12000rpm 離心30s-60s，得到DNA。

1.6 連接與消化

將鎖式探針與模板DNA進(jìn)行環(huán)化連接，反應(yīng)體系如表2。在PCR儀中94℃預(yù)熱5min，接著以94℃ 15s、65℃ 5min 進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，然后再95℃反應(yīng)15min。環(huán)化連接反應(yīng)結(jié)束后，離心管立即冰浴5min。接下來，按照表3配制消化體系，并在PCR儀中以37℃ 2h、95 ℃ 2.5h進(jìn)行消化反應(yīng)。消化后的產(chǎn)物作為qPCR模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 環(huán)化連接體系

表3 消化體系

1.7 熒光定量PCR

將連接消化后的環(huán)化鎖式探針作為模板，然后用擴(kuò)增引物 P1/P2 進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR反應(yīng)體系的配制參考TaKaRa Ex Taq試劑盒說明進(jìn)行（表4），擴(kuò)增曲線應(yīng)用Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System的操作方法進(jìn)行。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性 10 s，然后以 95℃ 15 s，60℃ 1 min 進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)。

表4 熒光定量PCR反應(yīng)體系(20uL)

1.8 特異性檢測(cè)

以豬、羊、牛的DNA 為模板，分別與鴨源16s rDNA鎖式探針進(jìn)行連接、消化，然后用連接消化后的產(chǎn)物與擴(kuò)增引物padR/padF和熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測(cè)，并以無菌水設(shè)置空白對(duì)照。

1.9 靈敏度檢測(cè)

確定鴨源成分DNA濃度后，經(jīng)無菌水10倍濃度梯度稀釋后，各取適量體積與鴨源16s rDNA鎖式探針進(jìn)行連接、消化，并與擴(kuò)增引物padR/padF和熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 鎖式探針連接環(huán)化驗(yàn)證

為確認(rèn)鎖式探針連接環(huán)化成功，我們采用RCA法對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。通過瓊脂糖凝膠電泳可以看到擴(kuò)增產(chǎn)物具有典型的階梯狀條帶分布，說明鎖式探針連接和環(huán)化成功（圖1）。

圖1 鴨源16s rDNA RCA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 The electrophorogram of RCA for duck 16s rDNA

2.2 基于鎖式探針的熒光定量PCR對(duì)鴨源性成分檢測(cè)

為驗(yàn)證基于鎖式探針的熒光定量PCR是否可用于鴨源性成分檢測(cè)，我們以連接環(huán)化的鎖式探針為模板進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中分別以無菌雙蒸水、無連接酶連接反應(yīng)液和無鴨源性成分DNA連接反應(yīng)液為對(duì)照。從圖2結(jié)果可知，只有鎖式探針連接環(huán)化成功后才能在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中得到陽性信號(hào)，而對(duì)照組實(shí)驗(yàn)均沒有出現(xiàn)信號(hào)（圖2）。該結(jié)果初步證明基于鎖式探針的熒光定量PCR可用于鴨源性成分的檢測(cè)。

圖2 基于鴨源16s rDNA鎖式探針的熒光定量PCR檢測(cè)Fig.2 Amplification of duke 16s rDNA by real-time PCR based on padlock probe

2.3 特異性檢測(cè)

為驗(yàn)證2.2中實(shí)驗(yàn)的特異性，我們對(duì)豬源、牛源和羊源的DNA分別與鴨源16s rDNA鎖式探針進(jìn)行連接環(huán)化，然后再利用熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有鴨源性成分DNA-鎖式探針連接環(huán)化產(chǎn)物才有熒光信號(hào)出現(xiàn)，結(jié)果為陽性，其余三組產(chǎn)物與和無菌雙蒸水一樣均為陰性結(jié)果（圖3）。上述結(jié)果說明本研究中的鎖式探針具有十分高的特異性，可用于鴨源性成分特異性檢測(cè)。

圖3 基于鴨源16s rDNA鎖式探針的熒光定量PCR檢測(cè)的特異性Fig.3 Specify of real-time PCR based on padlock probe for duke 16s rDNA

2.4 靈敏度檢測(cè)

除了特異性之外，我們也十分關(guān)心該鎖式探針的靈敏度。首先，鴨源性成分DNA經(jīng)過10倍濃度梯度稀釋，然后再分別取7 ng·μL-1、700 pg·μL-1、70 pg·μL-1、7 pg·μL-1、700 fg·μL-1、70 fg·μL-1、7 fg·μL-17個(gè)濃度與鎖式探針接連、消化并經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率K為-3.3286（圖4），表明擴(kuò)增反應(yīng)正常。結(jié)果顯示，除了7 fg·μL-1，上述濃度DNA的連接環(huán)化產(chǎn)物都能檢測(cè)到陽性信號(hào)，說明該鎖式探針可檢測(cè)的最低鴨源性成分DNA濃度是70 fg·μL-1（圖5）。

圖4 熒光定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 The amplification standard curve of real-time PCR

圖5 基于鴨源16s rDNA鎖式探針的熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度Fig.5 Sensitivity of real-time PCR based on padlock probe for duke 16s rDNA

3 討論

近年來，食品安全一直是國(guó)人關(guān)心的熱點(diǎn)問題，肉制品摻假就是其中讓人深惡痛絕的事件，尤以鴨肉假冒楊牛肉為甚?；赑CR技術(shù)的普及，已有多種PCR方法應(yīng)用于肉類產(chǎn)品鴨源性成分檢測(cè)，已經(jīng)報(bào)道過的有PCR法，熒光定量PCR法，多重實(shí)時(shí)熒光 PCR 法以及微滴數(shù)字PCR法。不過上述方法均存在缺陷。普通的PCR方法成本高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，耗費(fèi)人力物力；熒光定量PCR法成本高，而且假陽性出現(xiàn)概率比其他方法要高；多重實(shí)時(shí)熒光PCR法步驟煩瑣，不易操作；微滴數(shù)字PCR法作為新出現(xiàn)的技術(shù)，對(duì)于設(shè)備要求高，需要特定設(shè)備才能開展[5，13]。因此，本研究希望能為肉制品中鴨源性成分鑒定提供新的PCR方法。

鎖式探針具有極佳的特異性和靈敏度，實(shí)用性強(qiáng)，因此近來廣泛用于微生物、病原物種類檢測(cè)與鑒定。不過目前未有使用鎖式探針進(jìn)行鴨源性成分檢測(cè)的報(bào)道。本研究基于鴨線粒體基因組16s rDNA特異性序列設(shè)計(jì)鎖式探針和PCR引物，建立了基于鎖式探針的熒光定量PCR檢測(cè)肉制品中鴨源性成分快速檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合了鎖式探針的高特異性與熒光定量PCR的高靈敏性，可在試驗(yàn)的鴨肉、豬肉、羊肉和牛肉中特異性地檢測(cè)出鴨源性線粒體基因組的16s rDNA，而且檢測(cè)濃度達(dá)到70 fg·μL-1。這些結(jié)果表明基于鎖式探針的熒光定量PCR法具有高度特異性和靈敏度。

在鎖式探針設(shè)計(jì)中，靶基因選擇是首要考慮的問題。相比較于核基因組，線粒體基因組速度更快，種內(nèi)遺傳穩(wěn)定，種間高度變異，即使親緣關(guān)系較近的種屬也存在有特異的線粒體組基因[3，14]。其次，在所有細(xì)胞中均有大量的線粒體，保證可大量獲得模板DNA[15]。另外，在肉制品制作過程中核基因組經(jīng)常被破壞，然而線粒體基因組經(jīng)過特殊處理后仍能保持完整[4，15]。因此線粒體組DNA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性檢測(cè)[3]。

另外，如何保證探針特異性也是十分重要的方面。鎖式探針具有單堿基錯(cuò)配識(shí)別功能，如果錯(cuò)配位置位于探針3`末端，由于錯(cuò)配會(huì)導(dǎo)致連接失敗[8，12]。因此，我們選取具有高度種屬特異性的16s rDNA作為模板靶標(biāo)DNA序列，將鎖式探針的3`末端選擇在與16s rDNA序列高度一致的堿基序列位置，保證鎖式探針3`末端與靶標(biāo)DNA完全互補(bǔ)，確保檢測(cè)的特異性。

4 結(jié)論

本研究采用鴨線粒體16s rDNA作為靶基因，并以此設(shè)計(jì)特異性鎖式探針，結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)驗(yàn)證，本方法特異性好，靈敏度高，可有效快速檢測(cè)鴨源性成分，為肉類摻假鑒定提供了新的技術(shù)手段。