參黃搽劑的質(zhì)量標準研究Δ

江潔怡，李素梅，胥愛麗，李養(yǎng)學（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州510095）

參黃搽劑為本院院內(nèi)制劑，由苦參、黃柏、大黃、黃芩、冰片五味中藥經(jīng)水煎濃縮后制備而成，具有清熱燥濕、解毒止癢等作用，用于治療皮炎、接觸性皮炎、痤瘡及毛囊炎等病，癥見皮膚紅腫、瘙癢滲液，癥屬濕熱毒蘊者均適用。作為方中君藥，苦參具有多種藥理活性，如抗病原微生物、抗炎、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)等[1]，而苦參堿和氧化苦參堿作為苦參中的主要藥效成分，具有抗過敏[2]、抑菌[3-4]、抗病毒[5-6]、抗炎[7]、抗心律失常[8]、抗腫瘤[9]、抗纖維化[10]等作用。黃柏具有降血壓、抑菌、抗癌等藥理活性[11]，大黃具有瀉下、止血、抗炎、抗氧化等藥理活性[12]，黃芩具有抑菌、抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎等藥理活性[13-14]，以上三藥共為臣藥，共同發(fā)揮增強君藥清熱解毒、燥濕的作用。冰片為使藥，具有抑菌、消炎鎮(zhèn)痛等藥理活性，且冰片作為常用的佐使藥，與其他藥味配伍時，能起到提高藥物生物利用度的作用[15-16]。本制劑在臨床應用多年，療效確切，但其質(zhì)量標準較低?，F(xiàn)有質(zhì)量標準僅對苦參、大黃兩味藥材進行薄層鑒別[17]，為了有效地控制該制劑質(zhì)量，確保臨床用藥的安全性和有效性，本研究擬采用薄層鑒別法（TLC）對該制劑中苦參、黃柏、大黃、黃芩四味藥材進行定性鑒別，同時采用高效液相色譜法（HPLC）測定方中苦參堿和氧化苦參堿的含量，為其質(zhì)量標準的制訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀（美國Agilent公司）；TLC SAMPLER 4型自動點樣儀、Reprostar 3薄層成像系統(tǒng)（瑞士Camag公司）；XS205 DU型電子分析天平（美國Mettler-Toledo公司）；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（重慶金控科技有限公司）；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；Micro 17R型微量離心機（美國Thermo公司）；KQ-700DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-QAdvantage型A10自動純水機（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

參黃搽劑（由廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院提供，批號：180604、180605、180606，規(guī)格：每瓶裝30 mL，每1 mL含生藥82 mg）；苦參對照藥材（批號：121019-201708）、黃柏對照藥材（批號：121510-201105）、大黃對照藥材（批號：120984-201202）、黃芩對照藥材（批號：120955-201309）、苦參堿對照品（批號：110805-201709，純度：98.7%）、大黃酸對照品（批號：110757-201607，純度：99.3%）、氧化苦參堿對照品（批號：110780-201508，純度：92.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板、硅膠H薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈等液相用試劑為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參、黃柏、大黃、黃芩的定性鑒別

2.1.1 苦參 取參黃搽劑25 mL，加濃氨水調(diào)pH為8～9，然后用三氯甲烷萃取2次，每次30 mL；取萃取后的三氯甲烷液，蒸干后殘渣加三氯甲烷1 mL溶解，作為供試品溶液。另取苦參對照藥材0.5 g，加水150 mL，加熱微沸提取1 h，濾過并濃縮至約25 mL，加濃氨水調(diào)溶液pH為8～9，然后照供試品溶液處理法制成對照藥材溶液。另取苦參堿對照品適量，加乙醇制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。按處方工藝制備缺苦參的陰性樣品，同供試品溶液處理方法制成缺苦參的陰性對照溶液。照2015年版《中國藥典》（后文簡稱“藥典”）（四部）通則0502[18]中TLC法進行測定，吸取上述制備好的4種溶液各10μL，分別點于同一用1%NaOH溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8∶3∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出晾干后，再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1，V/V/V/V，10℃以下放置）上層溶液為展開劑，展開，取出晾干，用碘化鉍鉀試液顯色。結(jié)果，在供試品色譜圖上，在與對照藥材/對照品圖譜相同位置上有對應斑點出現(xiàn)，且陰性對照無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 苦參的TLC圖Fig 1 TLC chromatograms of S.flavescens

2.1.2 黃柏 取黃柏對照藥材0.1 g，加水約150 mL，加熱微沸提取1 h，濾過并濃縮至約25 mL，加濃氨水調(diào)溶液pH至8～9，同“2.1.1”項下供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按處方工藝制備缺黃柏的陰性樣品，同“2.1.1”項下供試品溶液制備方法制成缺黃柏的陰性對照溶液。照藥典（四部）通則0502[18]中TLC法進行測定，吸取已制備好的2種溶液和“2.1.1”項下的供試品溶液各5μL，分別點于同一以0.5%羧甲基纖維素鈉為黏合劑制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4，V/V/V，10℃以下放置）下層溶液作為展開劑，置于以氨氣熏蒸預飽和的展缸中，展開，取出晾干，置于紫外光燈（波長為365 nm）下檢視。結(jié)果，在供試品色譜圖上，在與對照藥材圖譜相同位置上有對應斑點出現(xiàn)，且陰性對照無干擾，結(jié)果見圖2。

2.1.3 大黃 取參黃搽劑15 mL，加鹽酸1 mL，水浴回流30 min，立即冷卻，用乙醚萃取2次，每次20 mL；取萃取后的乙醚溶液，蒸干后加三氯甲烷1 mL溶解，得供試品溶液。另取大黃對照藥材0.3 g，加水150 mL，加熱微沸提取1 h，濾過并濃縮至約15 mL，再加鹽酸1 mL，然后按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。另取大黃酸對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按處方工藝制備缺大黃的陰性樣品，然后按供試品溶液制備方法制成缺大黃的陰性對照溶液。照藥典（四部）通則0502[18]中TLC法進行測定，吸取制備好的供試品溶液、陰性對照溶液各8μL，對照藥材溶液、對照品溶液各4μL，分別點于同一以0.5%羧甲基纖維素鈉為黏合劑制備的硅膠H薄層板上，用石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層溶液作為展開劑，展開，取出晾干后，置于氨氣中熏至斑點清晰，于紫外光燈（波長為365 nm）下檢視。結(jié)果，在供試品色譜圖上，在與對照藥材圖譜相同位置上有對應斑點出現(xiàn)，且陰性對照無干擾，結(jié)果見圖3。

圖2 黃柏的TLC圖Fig 2 TLC chromatograms of P.chinense

圖3 大黃的TLC圖Fig 3 TLC chromatograms of Rhei Radix Et Rhizoma

2.1.4 黃芩 取參黃搽劑20 mL，蒸至近干，加硅藻土適量吸附，蒸干，加乙酸乙酯20 mL，超聲（功率：700 W，頻率：40 kHz）提取30 min，濾過，蒸干后殘渣加甲醇2 mL溶解，得供試品溶液。另取黃芩對照藥材1 g，加水150 mL，加熱微沸提取1 h，濾過并蒸至近干，加硅藻土適量吸附，蒸干，然后按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按處方工藝制備缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成缺黃芩的陰性對照溶液。照藥典（四部）通則0502[18]中TLC法進行測定，吸取制備好的3種溶液各2μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2，V/V/V/V）混合溶液為展開劑，置于展缸中預飽和30 min，取出晾干，于紫外光燈（波長為365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜圖上，在與對照藥材圖譜相同位置上有對應斑點出現(xiàn)，且陰性對照無干擾，結(jié)果見圖4。

圖4 黃芩的TLC圖Fig 4 TLC chromatograms of S.baicalensis

2.2 苦參堿、氧化苦參堿的含量測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Phenomenex Luna NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-無水乙醇-3%磷酸水溶液（80∶10∶10，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：45 ℃；進樣量：5 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液：分別精密稱取苦參堿、氧化苦參堿對照品適量，用無水乙醇-乙腈（20∶80，V/V）溶液溶解，并制成苦參堿、氧化苦參堿質(zhì)量濃度分別為407.20、420.15 μg/mL的單一貯備液，備用。分別取苦參堿、氧化苦參堿貯備液適量，加無水乙醇-乙腈（20∶80，V/V）溶液制成苦參堿、氧化苦參堿質(zhì)量濃度分別為81.44、168.06 μg/mL的混合對照品溶液。（2）供試品溶液：精密量取離心（3 000 r/min，5 min）后的參黃搽劑上清液15 mL，加濃氨水0.5 mL，放置30 min，然后用三氯甲烷萃取5次，每次20 mL，末次萃取后收集萃取液離心破乳，合并三氯甲烷液，蒸干后殘渣用無水乙醇溶解，并轉(zhuǎn)移到5 mL量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）陰性對照溶液：按參黃搽劑處方工藝制備缺苦參的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺苦參的陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液（樣品批號：180604）、陰性對照溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，以苦參堿、氧化苦參堿峰計的理論板數(shù)分別為3 333、6 407，分離度均＞1.5，且陰性對照無干擾，表明該方法具有良好的專屬性，色譜圖見圖5。

圖5HPLC圖Fig 5 HPLC chromatograms

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2（1）”項下制備好的對照品貯備液適量，加乙腈-無水乙醇（80∶20，V/V）溶液分別制成每1 mL含苦參堿40.72、81.44、22.16、162.88、203.60、244.32 μg和含氧化苦參堿42.02、63.02、84.03、105.04、168.06 μg的混合對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）對進樣量（x）進行線性回歸，得到苦參堿的回歸方程為：y＝0.458 0x－4.980 6（r＝0.999 4），氧化苦參堿的回歸方程為：y＝0.514 2x－5.043 0（r＝0.999 7）。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿分別在進樣量為203.60～1 221.60、210.08～840.30 ng范圍內(nèi)與其峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2.5 檢測限與定量限考察 采用逐步稀釋法測定苦參堿、氧化苦參堿的檢測限，以信噪比為3（S/N＝3）得出檢測限，以S/N＝10得出定量限。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參的檢測限分別為50.90、57.30 ng，定量限分別為169.67、168.06 ng。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取制備好的同一供試品溶液（樣品批號：180604）5 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為1.72%、2.23%（n＝6），表明該色譜條件下方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取制備好的同一供試品溶液（樣品批號：180604）5 μL，按“2.2.1”項下色譜條件，分別在制備樣品后0、5、10、15、20、24 h進樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為1.55%、2.77%（n＝6），均＜3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復性試驗 取同一批次參黃搽劑（樣品批號：180604），按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為47.34、30.64 μg/mL，RSD 分別為 2.84%、2.89%（n＝6），均＜3%，表明該方法具有良好的重復性。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批次參黃搽劑（樣品批號：180604）7.5 mL，分別按供試品含量的50%、100%、150%加入苦參堿、氧化苦參堿對照品，再按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，每個濃度平行制備3份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果顯示，苦參堿和氧化苦參堿的平均加樣回收率分別為96.13%、100.93%，RSD分別為2.55%、2.69%（n＝9），表明該方法準確度較好，結(jié)果見表1。

表1 回收率測定結(jié)果（n＝9）Tab 1Determination results of relovery rate（n＝9）

2.2.10 樣品含量測定 分別精密吸取3個批次參黃搽劑的供試品溶液及混合對照品溶液各5 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，每個樣品測2次，記錄峰面積并計算樣品中苦參堿和氧化苦參堿的含量。結(jié)果顯示，3個批次樣品中苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為46.98、31.02 μg/mL，平均總含量為78.00 μg/mL。根據(jù)3批樣品含量測定結(jié)果可知，制劑中苦參堿和氧化苦參堿總量的平均值為2.34 mg/瓶，按平均含量的80%設(shè)限[19]，初步擬定以苦參堿、氧化苦參堿總量計，每瓶制劑中不得少于1.87 mg。樣品中苦參堿、氧化苦參堿含量測定結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 TLC鑒別方法的確定

本研究對參黃搽劑中苦參、黃柏、大黃、黃芩分別進行了TLC鑒別，所建立的鑒別方法分離度良好、無拖尾現(xiàn)象，且陰性對照無干擾，專屬性強，能實現(xiàn)方中各藥味的快速鑒別?？鄥⒌蔫b別方法筆者參考了藥典（一部）[20]苦參項下收載的TLC法并有所調(diào)整，藥典（一部）中采用加氨水和三氯甲烷放置過夜進行藥材提取，筆者考慮到本制劑為經(jīng)提取過的液體，故將方法調(diào)整為加氨水調(diào)pH后用三氯甲烷萃取。另外，筆者曾采用在10℃以下放置的三氯甲烷-甲醇-濃氨（5∶0.6∶0.3，V/V/V）的下層溶液為展開劑進行展開，但斑點比移值（Rf）較高，改為本研究中所用二次展開系統(tǒng)展開后，斑點Rf值適中且分離度好。大黃的鑒別筆者參考了藥典（一部）[20]大黃項下收載的TLC法并有所調(diào)整，藥典（一部）中先加甲醇浸泡提取藥材，得甲醇液蒸干后，加水溶解，再加鹽酸回流提取，筆者考慮到本制劑為經(jīng)提取過的液體，故將方法調(diào)整為直接加鹽酸回流提??；另外，筆者曾用藥典展開方法展開，結(jié)果TLC圖譜中橙黃色熒光斑點不清晰，后改為置于氨氣預飽和的展缸中展開，結(jié)果斑點清晰。黃柏、黃芩的鑒別分別參考藥典（一部）[20]黃柏、黃芩項下收載的TLC法。

表2 參黃搽劑中苦參堿、氧化苦參堿含量測定結(jié)果（n＝2，μg/mL）Tab 2 Determination results of matrine and oxymatrine in shenghuang liniment（n＝2，μg/mL）

3.2 HPLC含量測定中供試品溶液制備方法的確定

參黃搽劑中苦參為君藥，筆者參考藥典（一部）[20]苦參項下收載的含量測定方法，考慮到本品為液體制劑，藥材已經(jīng)經(jīng)水煮提取，故選擇采用萃取的方法對樣品中有效成分進行提取。萃取時又發(fā)現(xiàn)樣品乳化較嚴重，如果不破乳會影響含量測定結(jié)果，經(jīng)離心破乳后，測定結(jié)果重復性高、穩(wěn)定性好，故采用離心的方法對末次萃取后的混合液進行破乳處理。測定樣品時筆者另發(fā)現(xiàn)，樣品測定結(jié)果平行性較差，經(jīng)排除人為誤差影響后，懷疑是處理過程中加氨水將待測生物堿成分游離出來了，該過程需要一定的反應時間，故筆者對加氨水后的放置時間進行了考察，發(fā)現(xiàn)加氨水后直接測定時結(jié)果平行性較差，而放置30 min后含量測定結(jié)果平行性好，且放置60 min與放置30 min比結(jié)果相差不大，故確定加氨水放置30 min后再進行測定。此外，筆者對萃取次數(shù)還進行了考察，發(fā)現(xiàn)苦參堿、氧化苦參堿的含量隨萃取次數(shù)的增加而增加，但萃取5次后，含量增加不明顯，表明萃取5次對苦參堿、氧化苦參堿的提取較完全，故選萃取5次作為樣品的提取次數(shù)。

3.3 HPLC色譜條件的確定

筆者曾參考藥典（一部）[20]苦參項下收載的含量測定方法，在藥典規(guī)定流動相的基礎(chǔ)上，對色譜柱、柱溫、流速進行了考察。在色譜柱方面，筆者分別考察了Waters Spherisorb NH2、Thermo Syncronis Amino、Phenomenex Luna NH2這3種不同色譜柱對分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)該方法對不同色譜柱適應性良好，但Phenomenex Luna NH2色譜柱的色譜峰峰形更好、保留時間適中，故最終選則Phenomenex Luna NH2作為含量測定的色譜柱。在柱溫方面，筆者分別考察了35、40、45℃這3種不同柱溫對分離效果的影響，結(jié)果當柱溫為35℃時，苦參堿和氧化苦參堿的分離度均低于1.5，當柱溫高于40℃后，苦參堿和氧化苦參堿的分離度均在1.5以上，且其分離度均隨柱溫的增加而升高，故最終選柱溫為45℃。在流速方面，筆者考察了0.8、1.0、1.2 mL/min這3種流速對分離效果的影響，結(jié)果流速對分離效果影響不大，綜合分析時間及儀器耐用性后，選擇1.0 mL/min作為分析流速。最終所建立的含量測定方法專屬性強、分離度好。

綜上所述，本研究建立了參黃搽劑中苦參、黃柏、大黃、黃芩四味藥材的TLC鑒別方法，在建立方法下測得的樣品斑點清晰、分離度高，且陰性對照無干擾。此外，本研究還建立了方中苦參堿和氧化苦參堿含量測定的HPLC法，并初步擬定了以苦參堿、氧化苦參堿總量計，每瓶中不得少于1.87 mg的質(zhì)量標準。本研究所建立的方法可行性高、重復性好，可用于參黃搽劑的質(zhì)量控制。