血清miRNA-21、IL-25表達(dá)水平與腎癌患者臨床特征的關(guān)系

嚴(yán)璞，周永建，張勇

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院泌尿外科，北京 100070

細(xì)胞學(xué)因子的改變或基因水平的相關(guān)改變，均能夠通過影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[1]。微小RNA-21（microRNA 21，miRNA-21）表達(dá)水平升高時(shí)，能夠通過加劇腫瘤細(xì)胞增殖，提高腫瘤細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄速度，進(jìn)而促進(jìn)腎癌患者的病情進(jìn)展[2]。白細(xì)胞介素-25（interleukin 25，IL-25）是免疫調(diào)節(jié)性相關(guān)因子，能夠通過提高T淋巴細(xì)胞的免疫活性，降低T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答水平，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[3]。相關(guān)研究對miRNA-21表達(dá)與膀胱癌的關(guān)系進(jìn)行探討，認(rèn)為膀胱癌患者的miRNA-21表達(dá)水平明顯增高，而且miRNA-21的表達(dá)水平與膀胱癌患者的臨床特征密切相關(guān)[4]。但目前仍缺乏關(guān)于miRNA-21、IL-25的表達(dá)與腎癌關(guān)系的研究。本研究對首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院確診的60例腎癌患者進(jìn)行研究，探討了miRNA-21、IL-25的表達(dá)情況及其與腎癌患者臨床特征的關(guān)系，旨在為臨床上腎癌患者的病情評估提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年7月至2017年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院確診的腎癌患者60例為腎癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會泌尿外科學(xué)會制定的《腎細(xì)胞癌診治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)[5]，F(xiàn)uhrman分級為Ⅰ～Ⅲ級；②年齡36～65歲；③經(jīng)計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）或病理學(xué)檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有全身感染性疾病；②伴有免疫功能缺陷；③合并其他部位惡性腫瘤；④患有腎結(jié)石；⑤有放化療史及免疫治療史。選取同期于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院體檢的健康體檢者60例為對照組。腎癌組患者中，男42例，女18例；年齡36～65歲，平均（48.2±9.3）歲；Fuhrman分級：Ⅰ級14例，Ⅱ級22例，Ⅲ級24例；腫瘤直徑＞4 cm 23例，腫瘤直徑≤4 cm 37例；腫瘤分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期23例，Ⅲ期16例，Ⅳ期5例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。對照組患者中，男40例，女20例；年齡35～65歲，平均（49.8±10.0）歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，所有受試者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清IL-25水平

采集健康體檢者體檢時(shí)和腎癌患者入院后24 h內(nèi)或治療后6～8 h的肘部靜脈血4 ml，1500 r/min離心15 min，收集上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血清IL-25水平，在每個(gè)聚苯乙烯板反應(yīng)孔中加入上述收集的上清液0.1 ml，4℃過夜孵育；加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，每次3 min；在每個(gè)聚苯乙烯板反應(yīng)孔中加入IL-25抗體（1∶800，購自南京伯斯金生物公司），37℃孵育30 min；加入PBS洗滌3次，每次3 min；每孔中加入 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）溶液底物0.1 ml，37 ℃20 min；加入2 mol/L硫酸0.05 ml終止反應(yīng)。采用DG5033A酶標(biāo)儀進(jìn)行IL-25水平測定。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測血清miRNA-21水平

采集健康體檢者體檢時(shí)和腎癌患者入院后第2天的肘部靜脈血4 ml，3500 r/min離心15 min后室溫下放置30 min，收集上層液體，于-20℃條件下保存待檢。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測miRNA-21的表達(dá)水平。采用上海雨婷生物科技公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，并逆轉(zhuǎn)錄成cRNA后進(jìn)行基因擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用Primer 5軟件進(jìn)行內(nèi)參基因和目的基因的引物設(shè)計(jì)及合成，miRNA-21的上游引物：5'-TTTGGCTCTGACCATTCTGT-3'；下游引物：5'-GTCCTCACCTGAGGGACCCC-3'，經(jīng)歷40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行曲線溶解，每個(gè)孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取Threshhold設(shè)置下的Ct平均值，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-21的表達(dá)水平，△Ct（n）=Ct目的基因（n）-Ct內(nèi)參基因（n），△△CT（n）=△Ct（n）-△Ct（1）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miRNA-21、IL-25表達(dá)水平的比較

腎癌組血清miRNA-21、IL-25表達(dá)水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組受試者血清miRNA-21、IL-25表達(dá)水平的比較（±s）

表1 兩組受試者血清miRNA-21、IL-25表達(dá)水平的比較（±s）

組別miRNA-21 IL-25（pg/ml）腎癌組（n=60）對照組（n=60）t值P值8.44±3.92 1.60±0.78 13.256 0.000 107.4±47.2 66.8±16.5 6.290 0.000

2.2 不同臨床特征腎癌患者血清miRNA-21、IL-25表達(dá)水平的比較

不同F(xiàn)uhrman分級、腫瘤直徑、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況腎癌患者的血清miRNA-21表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同F(xiàn)uhrman分級、腫瘤直徑腎癌患者的血清IL-25表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腫瘤分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腎癌患者的血清IL-25表達(dá)水平高于腫瘤分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.490、3.763，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征腎癌患者的血清miRNA-21、IL-25表達(dá)水平（n=60）

3 討論

腎癌的病情進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)較高，遠(yuǎn)期整體生存預(yù)后較差。長期的臨床隨訪觀察研究發(fā)現(xiàn)，腎癌患者的中位生存時(shí)間、生存率等較差，治療后患者生活質(zhì)量的改善仍較為局限[6-7]。相關(guān)研究表明，手術(shù)及放化療治療后，腎癌患者的無瘤生存時(shí)間仍短于36個(gè)月，且病情控制滿意度低于30%[8-9]。對腎癌患者血清中miRNA-21、IL-25的表達(dá)情況進(jìn)行研究，不僅能夠揭示腎癌病情進(jìn)展的生物學(xué)機(jī)制，同時(shí)還能夠?yàn)榕R床上腎癌的免疫靶向治療、早期血清指標(biāo)篩查或臨床預(yù)后的隨訪提供參考。

miRNA-21是非編碼RNA家族成員，能夠通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分化障礙，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。miRNA-21還能夠通過影響腫瘤細(xì)胞的變形和浸潤能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基底膜組織，從而導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)移行上皮組織的損傷和破壞[2]。IL-25作為白細(xì)胞介素家族成員，其不僅能夠參與炎性反應(yīng)過程，還能夠影響患者的自身免疫性調(diào)節(jié)過程。IL-25的表達(dá)水平升高時(shí)，能夠通過抑制樹突狀細(xì)胞的抗原提呈功能，降低T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的捕捉和吞噬能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的逃逸。在生物學(xué)水平進(jìn)行的相關(guān)研究表明，IL-25能夠參與腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控紊亂過程，加速腫瘤細(xì)胞的持續(xù)性自我擴(kuò)增[10]。

本研究通過對腎癌患者血清中miRNA-21、IL-25的表達(dá)情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示腎癌患者的血清miRNA-21、IL-25表達(dá)水平均較健康體檢者明顯升高（P＜0.01），提示miRNA-21、IL-25高表達(dá)，均能夠參與到腎癌的病情進(jìn)展過程。這主要由于miRNA-21、IL-25的表達(dá)上調(diào)，能夠通過下列機(jī)制影響腎癌的發(fā)生、發(fā)展[11-12]：①miRNA-21表達(dá)水平升高，不僅能夠影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，還能夠激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)腫瘤信號通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制和分裂速度；②IL-25表達(dá)水平升高，不僅能夠影響腫瘤細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)控，還能夠提高腫瘤細(xì)胞G1/S期的比值，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞快速跨越G0期。楊益等[12]研究結(jié)果顯示，相比于健康對照組，腎癌組患者的miRNA-21表達(dá)水平可平均上升55%左右，同時(shí)在合并有明顯腹腔積液或腫瘤惡病質(zhì)的患者中，miRNA-21的表達(dá)水平可進(jìn)一步上升，該結(jié)果與本研究結(jié)果相一致。本研究在對miRNA-21、IL-25表達(dá)與腎癌患者臨床特征的關(guān)系的探討中發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期較晚、腫瘤直徑較大的腎癌患者的血清miRNA-21表達(dá)水平均無明顯上升，推測miRNA-21的表達(dá)可能與腎癌患者的上述臨床特征并無明顯的關(guān)系。考慮其原因可能與本研究納入的腎癌患者的病例數(shù)量不足、miRNA-21檢測靈敏度的差別等有關(guān)。但腫瘤分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腎癌患者的血清IL-25表達(dá)水平高于腫瘤分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），提示IL-25的表達(dá)對腎癌患者的臨床特征具有一定的影響，究其原因可能為IL-25表達(dá)水平升高，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤深度的增強(qiáng)，促進(jìn)臨床分期的進(jìn)展，同時(shí)IL-25還能夠提高腫瘤細(xì)胞黏附淋巴結(jié)組織的能力，進(jìn)而促進(jìn)腎癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

綜上所述，腎癌患者的血清miRNA-21、IL-25表達(dá)水平均明顯上升，且IL-25的表達(dá)水平與腎癌患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。但本研究未能深入探討miRNA-21、IL-25的表達(dá)與腎癌患者臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)，故仍有待更進(jìn)一步的深入研究。