食管癌組織環(huán)狀-TTBK2和miR-217表達及臨床病理意義

徐勇軍 彭 琴 譚崢嶸 龍丹丹 魏亞元 徐繼宗

食管癌(esophageal cancer)是由于食管上皮組織異常增生引起的一種常見消化道惡性腫瘤。流行病學研究表明，我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，每年新增病例約占世界發(fā)病人數的一半[1]。由于食管癌早期癥狀不典型，多數患者確診時已發(fā)展至中晚期，錯過最佳治療時機，預后效果差，病死率較高[2]。不良飲食習慣、環(huán)境因素及遺傳易感因素等均可能導致食管癌的發(fā)生，但其發(fā)病的具體機制尚不清楚。因此，研究食管癌發(fā)生發(fā)展的機制，尋找防治食管癌的有效生物學靶標，可為食管癌的早期診斷、臨床治療及預后提供新思路。多項研究表明，微小RNA(miRNAs)參與多種生理生化過程，其異常表達與炎癥、癌癥等多種疾病的發(fā)生相關[3]。Li等[4]發(fā)現，miR-217在人卵巢上皮癌組織中顯著下調表達，過表達miR-217可促進卵巢上皮癌細胞的生長和遷移，但關于miR-217與食管癌的關系研究較少。

近年來研究表明，基因在轉錄時并不總是產生線性RNA，也會形成一些3′末端與5′末端相連的非編碼環(huán)狀RNAs，環(huán)狀RNAs結構穩(wěn)定，在血液和組織中與核內體或微囊結合，可作為疾病的生物學標志物[5]。Tau微管蛋白激酶2(Tau tubulin kinase 2，TTBK2)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種參與重要細胞過程的多功能激酶，維管系統參與多種細胞功能，是神經細胞骨架主要成分，Tau具有穩(wěn)定微管的作用，在微管相關蛋白中含量最高，TTBK2環(huán)狀RNA通過調節(jié)miR217等途徑調控膠質瘤惡性[6]。因此，本研究通過檢測并比較miR-217、環(huán)狀-TTBK2在食管癌腫瘤組織與癌旁組織中的表達情況，探討二者與食管癌臨床病理特征及預后的關系。

材料與方法

1.標本采集:選取2013年3月～2015年3月筆者醫(yī)院病理科收集的食管癌患者術后腫瘤組織及對應癌旁組織標本各69例為研究對象，患者年齡47～79歲，平均年齡59.67±10.23歲，其中食管病變部位：上段11例，中段40例，下段18例；病理類型：57例鱗癌、12例非鱗癌；腫瘤分化程度：高分化患者14例、中分化患者21例、低分化患者34例；浸潤深度：T1～T2患者30例，T3～T4患者39例；淋巴結轉移患者41例，淋巴結無轉移患者28例；根據國際抗癌協會TNM分期標準，Ⅰ期14例，Ⅱ期19例，Ⅲ期36例[7]。對所有入選患者進行為期3年的隨訪，并做好記錄，隨訪日期截止2017年4月30日。納入標準：①經病理診斷首次確診為食管癌患者的組織標本；②年齡不超過80歲患者的組織標本；③明確TNM分期及病理分化標本；④癌旁組織距腫瘤病灶組織距離超過5cm的組織標本；⑤患者的臨床及隨訪資料完整。排除標準：①非首次確診食管癌患者；②轉移性食管癌患者；③其它惡性腫瘤；④術前行放化療等其他輔助治療患者；⑤臨床或隨訪資料不完整患者。于術中分別收集食管癌腫瘤組織和癌旁組織，切成小塊(每塊體積1.0cm×1.0cm×1.0cm)，沖洗干凈后置于Trizol試劑中，-80℃保存。該研究經過筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準通過，標本采集和研究過程均符合赫爾辛基宣言。

2.主要試劑與儀器:Trizol試劑購自日本TaKaRa公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix購自南京vazyme生物公司；MystiCq?microRNA qPCR Assay Primer購自美國Sigma公司；qRT-PCR引物由上海生工生物公司合成等；qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司等。

3.實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-217、環(huán)狀-TTBK2表達水平：Trizol法提取兩組食管組織總RNA，反轉錄獲得cDNA。按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix試劑盒說明書對miR-217、環(huán)狀-TTBK2進行擴增。反應體系：正、反向引物(10μmol/L)各0.5μl，SYBR?Green Mix 5.0μl，cDNA(50ng/μl)1.0μl，ddH2O 3.0μl，共10.0μl。反應條件：95℃，90s；95℃，30s；62℃，30s；72℃，20s；40個循環(huán)，采用qRT-PCR儀進行檢測，通過溶解曲線評價qRT-PCR擴增產物的特異性。反應結束后，采用2-ΔΔCT法對擴增結果進行定量分析。qRT-PCR引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

結 果

1.食管腫瘤組織及癌旁組織中miR-217、環(huán)狀-TTBK2表達水平的比較:食管癌腫瘤組織中miR-217相對表達水平顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；食管癌腫瘤組織中環(huán)狀-TTBK2相對表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 不同食管組織中miR-217、環(huán)狀-TTBK2 表達水平的比較

2.食管癌患者腫瘤組織中miR-217與環(huán)狀-TTBK2表達的相關性:Pearson分析結果顯示，食管癌患者腫瘤組織中miR-217與環(huán)狀-TTBK2表達呈顯著負相關(r=-0.609)，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 食管癌患者腫瘤組織miR-217與環(huán)狀-TTBK2表達的相關性

3.食管癌患者腫瘤組織中miR-217、環(huán)狀-TTBK2表達情況與臨床病理特征的關系：以69例食管癌患者腫瘤組織中miR-217和環(huán)狀-TTBK2的平均水平為截斷值，將患者分為miR-217低表達組41例，miR-217高表達組28例，環(huán)狀-TTBK2低表達組26例，高表達組43例。不同年齡、性別、病變部位、病理類型、腫瘤浸潤深度的食管癌患者腫瘤組織中miR-217、環(huán)狀-TTBK2表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移情況的食管癌患者腫瘤組織中miR-217、環(huán)狀-TTBK2表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

4.不同miR-217、環(huán)狀-TTBK2表達食管癌患者3年總生存率的比較:如圖2所示，miR-217低表達者3年存活率為41.46%(17/41)，明顯低于miR-217高表達者3年存活率78.57%(22/28,χ2=9.238，P<0.05)；環(huán)狀-TTBK2高表達者3年存活率為37.21%(16/43)，明顯低于環(huán)狀-TTBK2陰性表達者3年生存率88.46%(23/26，χ2=15.780，P<0.05)。

5.影響食管癌患者預后的COX回歸分析:本研究將患者miR-217表達、環(huán)狀-TTBK2表達、年齡分層、性別、病變位置、病理類型、浸潤深度、腫瘤分化、淋巴結轉移、TNM分期等因素，納入影響食管癌患者預后的COX比例風險模型進行分析。單因素分析結果顯示，miR-217表達、環(huán)狀-TTBK2表達、浸潤深度、腫瘤分化、淋巴結轉移、TNM分期是影響食管癌患者預后的危險因素，詳見表4。多因素分析顯示，miR-217表達、環(huán)狀-TTBK2表達、TNM分期是影響食管癌患者預后的獨立危險因素，詳見表5。

討 論

食管癌是臨床上一種較為常見的消化道惡性腫瘤，多發(fā)生于40歲以后，其典型臨床癥狀是進行性吞咽困難。據報道，目前我國食管癌的發(fā)生率高達0.05%以上，是世界上高發(fā)病地區(qū)之一，每年約20萬人死于該種疾病，且發(fā)生率呈逐年升高的趨勢[8]?，F階段對于食管癌的病因尚不明確，認為由多種因素引起的食管鱗狀或腺狀上皮的持續(xù)性病變，最終都可能發(fā)展為食管癌。研究顯示，食管癌的5年存活率低于45%，中位存活時間不到32個月，病死率較高，易出現發(fā)和轉移，遠期預后效果較差[9]。因此，探索食管癌的發(fā)病機制，尋找有效生物學分子標志物，可為食管癌的臨床靶向治療和預后判斷提供新思路。

表3 食管癌患者腫瘤組織中miR-217、環(huán)狀-TTBK2表達情況與臨床病理特征之間關系

圖2 不同miR-217、環(huán)狀-TTBK2表達食管癌患者3年總生存率的比較

表4 影響食管癌患者預后單因素COX回歸分析結果

項目HR95% CIPmiR-217表達3.5761.237～10.3380.000環(huán)狀-TTBK2表達3.8541.569～9.4670.000年齡1.6150.577～4.5200.251性別1.7340.491～6.1240.134病理類型1.2480.679～2.2940.616浸潤深度1.9761.109～3.5210.043腫瘤分化2.5471.011～6.4170.035淋巴結轉移3.0391.348～6.8510.015TNM分期3.6431.914～6.9340.000

表5 影響食管癌患者預后多因素COX回歸分析結果

微小RNA(microRNA，miRNA)含有18～25個核苷酸，是真核生物細胞內一類高度保守的內源性單鏈非編碼RNA，能與靶基因mRNA 3′非編碼區(qū)特異性結合，調節(jié)基因轉錄和表達，在細胞增殖、細胞分化及細胞凋亡等生理生化過程中發(fā)揮非常重要的作用[10]。Ansari等[11]發(fā)現，miR-93、miR-143在食管鱗狀細胞癌腫瘤組織中表達明顯降低，可作為食管鱗癌的潛在生物學標志物。Wang等[12]研究發(fā)現，miR-625在食管癌組織中表達下調，低表達miR-625可促進食管癌細胞增殖、遷移，過表達miR-625則抑制食管癌細胞增殖、遷移，提示miR-761有望作為食管癌的治療靶點。Winther等[13]研究表明，miR-21在食管鱗癌和食管腺癌腫瘤組織中表達上調，miR-21高表達與食管鱗癌和食管腺癌患者的疾病特異性、生存率和總生存率較差有關，是影響患者不良預后的獨立危險因素，提示miR-21有望作為評價食管癌患者預后情況的生物學標志物。以上研究表明miRNAs在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中具有抑癌或致癌作用，可作為食管癌的潛在預后生物學標志物和治療靶點，然而miR-217在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用尚不清楚。

miR-217是哺乳動物常見的miRNA之一，存在于多種細胞、組織中。Su等[14]發(fā)現，miR-217在轉移性肝癌組織和高侵襲性肝細胞癌細胞系MHCC-97H細胞中的表達較低，過表達miR-217抑制MHCC-97H細胞侵襲能力，表明miR-217可能作為潛在的腫瘤抑制因子參與肝細胞癌的疾病進展。Lin等[15]分析發(fā)現，miR-217在甲狀腺癌組織和細胞系中表達下降，與患者臨床分期、淋巴結轉移情況有關，細胞實驗表明，過表達miR-217可顯著抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲，同時可抑制體內腫瘤的生長，提示miR-217作為抑癌因子參與甲狀腺癌的發(fā)展。Zhang等[16]發(fā)現miR-217在結腸癌組織中表達顯著高于癌旁組織，與結腸癌患者的臨床分期及總體生存率有關，過表達miR-217 可抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡，推測miR-217可能作為致癌因子參與結腸癌的發(fā)生。以上研究結果顯示，miR-217在惡性腫瘤發(fā)展和進展中既可作為抑癌基因也可作為致癌基因發(fā)揮作用。

本研究對69例食管癌腫瘤組織及對應癌旁組織進行檢測，發(fā)現食管癌組織中miR-217表達水平顯著降低，與miR-217等在肝細胞癌、甲狀腺癌中的表達模式一致[14,15]。提示miR-217在食管癌中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。本研究中miR-217表達與食管癌患者TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關，隨著患者TNM分期的升高、分化程度的降低，腫瘤組織中miR-217表達水平逐漸升高，有淋巴結轉移的患者腫瘤組織中miR-217表達水平高于未轉移患者。其中TNM分期和病理分化可反腫瘤的分化程度，分期分級越高，分化程度越差，腫瘤的惡性程度越高，提示miR-217低表達參與食管癌疾病的進展，與腫瘤惡性程度有關。進一步分析發(fā)現，miR-217低表達者3年存活率顯著低于miR-217高表達者，提示miR-217低表達與食管癌患者3年存活率有關，影響患者的預后，推測miR-217可作為反應食管癌惡性程度和患者預后的生物學標志物。

環(huán)狀RNAs是一類不編碼蛋白質的ncRNAs，大多數環(huán)狀RNA都來自外顯子區(qū)域，且多數分布于細胞質中。近期研究表明，環(huán)狀RNAs在胃癌、結腸癌等消化系統腫瘤中異常表達，參與惡性腫瘤的發(fā)生，逐漸作為一種新型生物學標志物應用于癌癥疾病的篩查[17，18]。Tau微管蛋白激酶2(Tau tubulin kinase 2，TTBK2)是一種激酶，可催化Tau蛋白和微管蛋白磷酸化而激活[19]。Bender等[20]發(fā)現，線性TTBK2過表達與腎癌細胞系和黑色素瘤細胞系的耐藥性密切相關。Zheng等[21]報道稱，在膠質瘤組織和細胞系中均發(fā)現環(huán)狀-TTBK2表達顯著上調，而線性-TTBK2表達無顯著變化，體外實驗進一步發(fā)現，過表達環(huán)狀-TTBK2促進膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，敲除環(huán)狀-TTBK2則可導致體內腫瘤的回歸，提示環(huán)狀-TTBK2高表達促進膠質瘤進展。

本研究發(fā)現，食管癌腫瘤組織中環(huán)狀-TTBK2表達水平顯著升高，與Zheng等[21]在膠質瘤中發(fā)現一致，提示環(huán)狀-TTBK2 在食管癌發(fā)生過程中可能作為致癌基因發(fā)揮作用。本研究中環(huán)狀-TTBK2表達與食管癌患者TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關，隨著患者TNM分期的升高、分化程度的降低，腫瘤組織中miR-217表達水平逐漸升高，提示環(huán)狀-TTBK2 高表達可能參與食管癌疾病進展。進一步分析發(fā)現，環(huán)狀-TTBK2高表達者3年存活率顯著低于環(huán)狀-TTBK2低表達者，提示環(huán)狀-TTBK2高表達與食管癌患者的生存率有關，影響患者的預后，推測環(huán)狀-TTBK2可能作為判斷食管癌患者疾病程度和預后情況的生物學標志物。本研究采用COX比例風險模型對影響食管癌患者預后的危險因素進行分析，結果顯示，miR-217表達、環(huán)狀-TTBK2表達、TNM分期是影響食管癌患者預后的獨立危險因素，提示檢測食管癌腫瘤組織miR-217、環(huán)狀-TTBK2表達情況可評估患者預后情況。另外，Pearson分析表明，食管癌腫瘤組織中miR-217與環(huán)狀-TTBK2表達呈負相關，表明二者某種方式相互作用，然而具體以何種方式共同參與調節(jié)食管癌的發(fā)生和進展仍不明確，將在進一步研究中進行探索。

綜上所述，本研究結果顯示，miR-217在食管癌患者腫瘤組織中低表達，環(huán)狀-TTBK2高表達，二者表達與患者TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移及3年存活率有關，是影響食管癌患者預后的獨立危險因素，推測二者可能作為治療食管癌的潛在靶標，并用于判斷患者預后。