吸煙對慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部線粒體的影響

呂媛媛，王必斌，管敏鑫

(1.寧波李惠利醫(yī)院檢驗科，浙江 寧波 315040； 2.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 310003； 3.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的疾病，其病理特點是慢性氣道炎癥、肺氣腫，最終發(fā)展成不可逆的氣流阻塞[1]。COPD病因復雜，目前較為明確的病因主要有吸煙和空氣污染，隨著吸煙人群的增多和空氣污染的加重，預計到2020年，COPD將成為全球第三大死因[2-3]。香煙中含有4 800多種化合物，其中尼古丁、一氧化碳、氮氧化物、高濃度氧等成分可直接攻擊細胞，引起肺組織黏膜細胞損傷。線粒體是真核細胞中極為重要的細胞器，是細胞內氧化磷酸化和ATP合成的主要場所，線粒體DNA(mtDNA)缺少組蛋白保護和DNA修復系統，暴露于高濃度的活性氧狀態(tài)下容易受到損傷[4]。mtDNA數量和質量如果發(fā)生改變，可能引起線粒體功能障礙，直接影響細胞功能。本研究以C57BL/6小鼠為研究對象，構建煙熏COPD小鼠模型，研究吸煙對小鼠肺部線粒體數量和功能的影響，揭示線粒體損傷在COPD發(fā)生和發(fā)展中的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠，購自上海動物實驗中心，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.1.2 試驗儀器

熏煙箱為自制玻璃箱，尺寸為70 cm×50 cm×50 cm；全自動組織切片機，德國Leica公司；熒光定量PCR儀，美國ABI公司；酶標儀，美國BioTek公司；Western blot電泳設備，美國Bio-Rad公司。

1.1.3 試劑耗材

大前門牌香煙，上海卷煙廠；SYBR?Green PCR Master試劑盒，美國ABI公司；抗鼠線粒體抗體(anti-ND5，anti-CO2，anti-VDAC)、二抗，英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 COPD小鼠模型建立

將30只小鼠隨機分為正常組和處理組，每組15只，飼養(yǎng)環(huán)境相同(溫度2l～26 ℃，濕度30%～70%)，自由飲食。根據文獻[5]方法對處理組小鼠進行煙霧暴露：每日煙熏2次，每次6支香煙，每次煙熏0.5 h，每周5 d，共煙熏3個月。

1.2.2 肺組織免疫組化

試驗3個月后，小鼠麻醉并頸動脈處死，取肺組織經4%甲醛固定、石蠟包埋后切片，采用SP三步法進行免疫組化[6]。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測肺組織細胞線粒體拷貝數

取小鼠肺組織3～5 g，勻漿，蛋白酶消化后用酚氯仿法直接提取小鼠細胞DNA，測定總DNA濃度。使用實時熒光定量PCR檢測肺組織細胞線粒體拷貝數。小鼠線粒體編碼的ND1正向引物為5′-CCCATTCTAATCGCCATAGC-3′，反向引物為5′-TAT GGCGTCTGCAAATGGTT-3′；小鼠核基因編碼的GAPDA基因作為內參，正向引物為5′-AAGGCTGTGGGCAAGG-3′，反向引物為5′-AAGGTGGAAGAGTGGGAGT-3′。按照試劑盒說明書進行檢測，DNA模板濃度為500 nmol·L-1，添加量1 μL。反應程序為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，共40個循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。反映結束后，計算2-ΔΔCt值[7]，比較處理組和正常組mtDNA拷貝數(相對于核基因組)。

1.2.4 Western Blot檢測肺部細胞線粒體蛋白表達水平

取小鼠肺組織3～5 g，勻漿，加入500 μL RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清，獲得蛋白溶液，BCA法測蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠，蛋白上樣量為20～30 μg，電泳后轉至PVDF膜上，牛奶粉封閉2 h，孵一抗4 ℃過夜，次日孵二抗洗膜曝光。

1.2.5 數據統計分析

采用SPSS軟件對數據進行單因素方差分析及t檢驗，測定結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 吸煙對小鼠肺的損傷

如圖1所示，正常組小鼠肺組織肺泡壁結構連續(xù)、完整，肺泡間隔可見，煙熏處理組小鼠肺組織正常肺泡結構破壞，多個肺泡相互融合形成較大的肺大泡腔，與人類COPD患者肺組織形態(tài)結構相似，提示COPD小鼠模型構建成功。

A，正常組小鼠肺部；B，處理組小鼠肺部圖1 小鼠肺部病理切片(200×)

2.2 吸煙對小鼠肺部細胞線粒體DNA的影響

如圖2所示，處理組小鼠肺部細胞線粒體DNA拷貝數較正常組明顯下降。

圖2 熒光定量PCR結果

2.3 吸煙對小鼠肺部細胞線粒體蛋白合成功能的影響

ND5、CO2蛋白是線粒體呼吸鏈復合體I、IV中重要多肽成分，由線粒體DNA編碼。如圖3所示，處理組小鼠肺部細胞線粒體ND5、CO2蛋白表達水平相對于正常組分別下降了16.3%(P=0.007)和32.2%(P=0.06)。

圖3 Western Blot結果

3 討論

COPD是一種以氣流受限為特征的慢性炎癥性肺部疾病，病理生理特征復雜，發(fā)病機制尚未完全明了[8]。已有研究表明，吸煙是COPD的主要病因，約90%的COPD患者有吸煙史[9]。香煙煙霧中含有4 800多種化學物質，其中高濃度的ROS和親脂成分能夠通過細胞膜擴散至細胞內損傷線粒體[10]。線粒體呼吸鏈的正常運行不僅需要完整mtDNA分子結構，還需充分的mtDNA拷貝數。Liu等[11]研究發(fā)現，mtDNA拷貝數改變可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關。Lee等[12]研究發(fā)現，50%肺癌患者mtDNA拷貝數增加，而23%患者mtDNA拷貝數下降。本研究結果顯示，煙熏組COPD小鼠肺部mtDNA拷貝數相對于正常組下降，表明吸煙可能通過降低肺部mtDNA數量，從而影響線粒體的功能。線粒體的氧化磷酸化過程主要通過內膜上的電子傳遞鏈復合物發(fā)揮作用，復合體I、II、III、IV和V是電子傳遞鏈的主要組成部分[13]。人類的mtDNA編碼線粒體呼吸鏈13個重要多肽，線粒體蛋白表達異常會導致線粒體功能障礙和細胞損傷[14]。Lv等[15]研究發(fā)現，mtDNA改變可影響線粒體蛋白的表達從而導致線粒體功能障礙。本研究發(fā)現吸煙會降低肺線粒體蛋白表達水平。

綜上所述，本研究通過構建煙熏COPD小鼠模型，分析mtDNA拷貝數及線粒體蛋白表達水平在煙熏COPD小鼠體內的變化，探討了線粒體損傷與COPD致病機制的相關性，本研究的發(fā)現為探索COPD的致病機制提供了新的視野和方向。由于COPD致病機制復雜多樣，其致病機制與線粒體的確切關系還有待于進一步的研究。