湯陰北艾內(nèi)生真菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

劉淼，李文，劉元，張守泉，文春南，王寶倉(cāng)，劉明爽，麻兵繼*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材系，河南 鄭州 450002； 2.河南湯陰縣醫(yī)藥行業(yè)管理辦公室，河南 湯陰 456150)

艾草(ArtemisiaargyiH. Lév. & Vaniot)為菊科蒿屬多年生草本或略成半灌木狀植物，具有“回陽(yáng)，通十二經(jīng)，理氣血，逐濕寒，止血安胎”等功效[1]。艾草按產(chǎn)地生境，分為北艾、祁艾、蘄艾等。北艾分布于今河南湯陰縣內(nèi)，《本草綱目》記載“宋時(shí)以湯陰復(fù)道者為佳，……近代惟湯陰者謂之北艾……”[2]。湯陰北艾在宋、明、清時(shí)期作為貢品進(jìn)貢宮廷，具有極高的藥用和保健價(jià)值，素有“仙艾”的美稱(chēng)[3]?，F(xiàn)代檢測(cè)表明，湯陰北艾中桉油精含量達(dá)到0.191%。隨著北艾及其制品消費(fèi)量的不斷增加，如何提高湯陰北艾的品質(zhì)和產(chǎn)量，已成為制約北艾產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。

現(xiàn)代研究表明，藥材植株內(nèi)部的微環(huán)境，尤其是內(nèi)生真菌對(duì)藥材的品質(zhì)具有重要影響[4]。內(nèi)生真菌是指存在于健康植物的各種組織、器官內(nèi)部而不使植株表現(xiàn)任何病害癥狀的一類(lèi)真菌[5]。內(nèi)生真菌能夠直接或者間接影響藥材主要藥效成分的合成[6]，因此，內(nèi)生真菌成為眾多學(xué)科交叉研究的熱點(diǎn)，也是研究道地藥材品質(zhì)形成的新的切入點(diǎn)。本試驗(yàn)利用5種真菌培養(yǎng)基對(duì)湯陰北艾內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、純化，利用5.8S-ITS區(qū)序列分析技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行分子學(xué)鑒定，以期初步揭示湯陰北艾內(nèi)生真菌的種類(lèi)及種群分布特點(diǎn)，為下一階段湯陰北艾內(nèi)生真菌與其品質(zhì)的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

北艾植物樣本于2018年5月采自河南省湯陰縣扁鵲廟，由安陽(yáng)九頭仙艾有限公司提供。將采集的健康湯陰北艾全株植物樣本放入自封袋保存，24 h內(nèi)處理。

1.1.2 儀器與試劑

SW-CJ-2D型(名牌之星)雙人凈化工作臺(tái)，上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司；LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；QHZ-98 A全溫振蕩搖床，太倉(cāng)市華美生化儀器廠；GXZ型(多段編程)智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；湘儀H1650-W離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；基因擴(kuò)增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；電泳儀(JY300C通用電源，JY-SPCT水平電泳槽)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；2500R型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

真菌通用引物ITS1和ITS4，華大基因公司定制。PremixTaq酶、DNA marker(分子量標(biāo)記)、真菌基因組DNA提取試劑盒，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，加蒸餾水至1 L。

麥芽浸膏培養(yǎng)基(MEA)：麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，瓊脂15 g，加蒸餾水配至1 L。

孟加拉紅培養(yǎng)基(RBA)：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂18 g，孟加拉紅0.03 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L。

察氏培養(yǎng)基(CDA)：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L。

高氏1號(hào)培養(yǎng)基(GSA)：可溶性淀粉 200 g，硝酸鉀10 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，NaCl 0.5 g，硫酸亞鐵 0.1 g，瓊脂 18 g，蒸餾水1 L。

1.2 湯陰北艾內(nèi)生真菌的分離

1.2.1 樣品表面消毒

剪取健康的艾草莖、葉，用無(wú)菌水清洗干凈莖、葉表面，用濾紙吸取表面水分，然后放入無(wú)菌操作臺(tái)，紫外光照射10 min，每隔5 min翻動(dòng)一下莖、葉的接觸面，然后用無(wú)菌水沖洗表面，再依次用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇浸泡1～2 min，3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))次氯酸鈉浸泡2～3 min，75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇清洗30 s，最后用無(wú)菌水沖洗5次[7]。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分離純化

將表面消毒的樣品用濾紙吸干表面的水分。分別取最后一次沖洗過(guò)的無(wú)菌水200 μL涂布于5種培養(yǎng)基(PDA、MEA、CDA、RBA、GSA)平板上(設(shè)置3個(gè)重復(fù))作為對(duì)照，以觀察是否滅菌徹底。用滅過(guò)菌的手術(shù)剪將莖剪成3 mm左右的條段，將葉剪成3 mm×3 mm的小塊，然后采用平板十字法接種的方式，將莖、葉組織接種到滅菌后的培養(yǎng)基平板上(每種培養(yǎng)基重復(fù)6次)。將平板放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h觀察一次，將具有明顯菌落特征的真菌用接種針挑出，轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上，不斷分離、純化，直至得到單一的菌落[8]。

1.3 5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析

1.3.1 內(nèi)生真菌基因組DNA提取

采用試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)上的步驟提取內(nèi)生真菌基因，得到高質(zhì)量的DNA。

1.3.2 5.8S rDNA-ITS區(qū)基因片段的擴(kuò)增與序列測(cè)定

用于5.8S rDNA-ITS區(qū)基因片段PCR擴(kuò)增的引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAATGC-3′)。擴(kuò)增體系為25 μL：PremixTaq12.5 μL，ITS1 2 μL， ITS4 2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，54 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸15 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；12 ℃保溫10 min。將擴(kuò)增后的DNA用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳20 min，在凝膠成像儀中觀察目的基因條帶。若觀察到明顯的基因條帶，則將PCR產(chǎn)物送往華大基因測(cè)序公司進(jìn)行基因序列檢測(cè)。

1.3.3 內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，選出一致性最高且大于97%的序列，然后將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入到MEGA 7.0軟件中，用鄰接法對(duì)所有的內(nèi)生真菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾草表面的殺菌效果

在對(duì)湯陰北艾進(jìn)行表面消毒時(shí)，對(duì)設(shè)置的12個(gè)對(duì)照平板進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)均無(wú)菌落產(chǎn)生，表明艾草表面殺菌消毒徹底。

2.2 艾草內(nèi)生真菌的分離鑒定

將經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的5.8 SrDNA-ITS區(qū)域的測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，共從葉中分離得到3屬(鏈格孢屬Alternaria、耙齒菌屬I(mǎi)rpex、球毛殼屬Chaetomium)6種(鏈格孢菌Alternariasp.、極細(xì)鏈格孢霉Alternariatenuissima、球毛殼菌Chaetomiumglobosum、鏈格孢屬鏈格孢菌Alternariaalternata、白菜黑斑病菌Alternariabrassicae、白囊耙齒菌Irpexlacteu)內(nèi)生真菌，從莖中分離得到1屬(鏈格孢屬Alternaria)2種(極細(xì)鏈格孢霉Alternariatenuissima、鏈格孢屬鏈格孢菌Alternariaalternata)內(nèi)生真菌(表1)。鏈格孢屬菌為湯陰北艾的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌。

2.3 艾草內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育分析

將所得菌株采用MEGA 7.0軟件，以鄰接(N-J)法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。由親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近可將菌株分為3個(gè)種群：種群A(鏈格孢屬Alternaria)、種群B(耙齒菌屬I(mǎi)rpex)和種群C(球毛殼屬Chaetomium)。根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，種群A又可細(xì)分為2個(gè)種群(A1和A2)：種群A1包含鏈格孢屬鏈格孢菌Alternariaalternata、鏈格孢菌Alternariasp.、白菜黑斑病菌Alternariabrassicae和極細(xì)鏈格孢菌Alternariatenuissima；種群A2均為極細(xì)鏈格孢菌Alternariatenuissima。種群B和C均無(wú)下級(jí)分枝。

圖1 以鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 小結(jié)與討論

通過(guò)試驗(yàn)，從湯陰北艾的葉、莖中共分離得到13株內(nèi)生真菌，分屬于3屬(鏈格孢屬Alternaria、耙齒菌屬I(mǎi)rpex、球毛殼屬Chaetomium)6種(鏈格孢菌Alternariasp.、極細(xì)鏈格孢霉Alternariatenuissima、球毛殼菌Chaetomiumglobosum、鏈格孢屬鏈格孢菌Alternariaalternata、白菜黑斑病菌Alternariabrassicae、白囊耙齒菌Irpexlacteu)，葉中的菌群豐富度要大于莖中。

張冰洋[9]報(bào)道在河北省石家莊市的艾草中分離得到Fusariumsp、Penicilliumrapier、Penicilliumcitrinum、Fusariumoxysporum、Cladosporiumsp.等5種內(nèi)生真菌；楊倩[10]從蘄艾中分離得到一株黑孢霉屬球黑孢霉菌(Nigrosporaoryzae)。同前述結(jié)果相比，雖然本試驗(yàn)中湯陰北艾內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)較為單一，種群豐富度不高，但其具有獨(dú)特的菌群結(jié)構(gòu)，鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌為湯陰北艾內(nèi)生真菌菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬?；蛟S正是由于湯陰北艾獨(dú)特的菌群結(jié)構(gòu)，才造就了湯陰北艾的優(yōu)良品質(zhì)。本研究結(jié)果為下一階段闡明內(nèi)生真菌與湯陰北艾品質(zhì)的相互關(guān)系奠定了一定的基礎(chǔ)。