IL-22對骨髓來源巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響①

冼小龍 羅 薇 胡榜利 覃山羽 蘇思標(biāo) 姜海行

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,南寧 530021)

肝纖維化是肝臟慢性炎癥時引發(fā)持續(xù)性損傷修復(fù)反應(yīng)，導(dǎo)致肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，進(jìn)一步引發(fā)肝臟結(jié)構(gòu)改變和肝功能異常的一種病理過程，嚴(yán)重者可發(fā)展為肝硬化[1]。巨噬細(xì)胞在肝纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[2]。目前將巨噬細(xì)胞分成兩型，即促炎型(M1型巨噬細(xì)胞)和抗炎型(M2型巨噬細(xì)胞)。由脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)或干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)活化可形成M1型巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、IL-6等，招募集成纖維細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程[3]。

IL-22屬于IL-10家族，是新近發(fā)現(xiàn)的一種免疫介質(zhì)，主要由激活的Th22、Th17、Th1、NK、NKT等細(xì)胞分泌[4]。已有研究證實，IL-22誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSC)凋亡，抑制肝纖維化進(jìn)展，具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用[5,6]。目前IL-22在肝臟中的研究多集中于肝細(xì)胞和HSC，但對巨噬細(xì)胞的研究鮮有報道。因此，本研究重點探討IL-22對LPS誘導(dǎo)的骨髓來源巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6小鼠(6～8周，雄性)，體重18～22 g，SPF級，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號:SYXK(桂)2014-0002。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM，胎牛血清(美國Gibco);青鏈霉素(北京索萊寶)；M-CSF，rmIL-22(美國R&D)；脂多糖(美國Sigma)；乳膠微球(1 μm,美國Sigma)；ACCUTASE細(xì)胞消化液(加拿大StemCell)；Stain Buffer(FBS)，F(xiàn)ixation/Permeabilization Solution Kit，流式細(xì)胞儀FACSCantoⅡ(美國BD)；FITC標(biāo)記CD11b抗體，PerCP-Cyanine5.5標(biāo)記F4/80抗體，PE標(biāo)記iNOS抗體(美國ebioscience)；總RNA提取試劑盒(上海生物工程)；HiScript?Ⅱ One Step RT-PCR Kit(南京諾唯贊生物科技)；小鼠IL1-β、TNF-α ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程)。

1.2方法

1.2.1骨髓來源巨噬細(xì)胞的獲取及M1型巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo) 參考Weng等[7]的方法，頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精浸泡5 min,盡快將股骨與肌肉組織分離,用冰冷的PBS反復(fù)沖洗，將股骨從中間剪成兩段，用1 ml注射器吸取冰冷的PBS沖出骨髓，輕輕反復(fù)吹散細(xì)胞,以1 500 r/min離心5 min 棄上清，用2 ml 紅細(xì)胞裂解液重懸以裂解紅細(xì)胞，1 min后立即加入20 ml DMEM,充分混勻,過400目細(xì)胞篩，再以1 500 r/min 離心5 min，棄上清,沉淀用冰冷的PBS重懸清洗細(xì)胞2次,用含M-CSF(50 ng/ml)的DMEM完全培養(yǎng)基(含1%雙抗和10%胎牛血清)重懸細(xì)胞，計數(shù)按1×106個/ml細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)3 d后，重新?lián)Q含M-CSF(50 ng/ml)的DMEM完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)4 d。第7天換不含M-CSF的DMEM完全培養(yǎng)基去除非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為骨髓來源巨噬細(xì)胞(M0型巨噬細(xì)胞)。LPS(1 μg/ml)刺激M0型巨噬細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)形成M1型巨噬細(xì)胞。光鏡觀察M0及M1巨噬細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2吞噬功能實驗 培養(yǎng)于6孔板內(nèi)的骨髓巨噬細(xì)胞加入1 μl帶熒光標(biāo)記的乳膠微球，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用PBS洗掉未被骨髓巨噬細(xì)胞吞噬的乳膠微球，再用光鏡和熒光顯微鏡觀察骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓來源巨噬細(xì)胞的純度及M1型巨噬細(xì)胞的比例 用ACCUTASE細(xì)胞消化液消化細(xì)胞并計數(shù)后，按1 ×106個/ml分裝至EP管中,1 500 r/min離心5 min，PBS洗1遍,離心后棄上清,用FBS重懸細(xì)胞,加入FITC標(biāo)記CD11b抗體和PerCP-Cyanine5.5標(biāo)記F4/80抗體，4℃避光染色30 min,PBS洗1遍，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入Fixation/Permeabilization固定/破膜液500 μl,4℃固定15 min，加入3 ml Perm/Wash液洗1遍，1 500 r/min離心5 min棄上清,以Perm/Wash液重懸細(xì)胞，加入PE標(biāo)記iNOS抗體，4℃避光染色30 min,PBS洗1遍，1 500 r/min離心5 min棄上清，用200 μl PBS重懸后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4CCK8法檢測IL-22對細(xì)胞活性的影響 骨髓來源巨噬細(xì)胞懸液(1×104個/ml)接種至96孔板(100 μl/孔)，用不同濃度IL-22處理細(xì)胞36 h后，每孔加CCK8試劑10 μl，37℃溫育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值，按以下公式計算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(未加藥)-A(空白)]×100%。

1.2.5ELISA檢測巨噬細(xì)胞上清液IL1-β、TNF-α的分泌水平 收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測IL1-β、TNF-α的分泌。按照試劑盒說明操作，加入配好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，37℃溫育2 h，倒掉液體，加生物素標(biāo)記抗體混勻，37℃溫育1 h，洗3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素工作液，37℃溫育1 h，洗5次，加TMB底物，37℃溫育15～30 min，加終止液終止反應(yīng)，5 min內(nèi)讀板，450 nm波長檢測吸光度。

1.2.6RT-PCR檢測巨噬細(xì)胞iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)水平 按總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。按照HiScript?Ⅱ One Step RT-PCR Kit說明書進(jìn)行實時熒光定量RT-PCR檢測。擴(kuò)增條件：逆轉(zhuǎn)錄95℃ 3 min(1個循環(huán)),預(yù)變性95℃ 5min(1個循環(huán))，95℃ 10 s 、60℃ 30 s (40個循環(huán))。以GAPDH為內(nèi)參照基因，采用2-ΔΔCt計算iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Tab.1 Primers for target gene

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間均數(shù)差異比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1骨髓來源巨噬細(xì)胞的形態(tài)觀察 M0型巨噬細(xì)胞形態(tài)較圓，高亮，部分不規(guī)則形，偽足較少，見圖1A；M1型巨噬細(xì)胞體積略增大，胞質(zhì)有空泡，顏色變深，偽足增多，呈煎蛋樣，見圖1B。

2.2骨髓來源巨噬細(xì)胞的吞噬功能 通過熒光顯微鏡觀察骨髓來源巨噬細(xì)胞吞噬率達(dá)99%(吞噬率%=吞噬乳膠微球細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))，說明誘導(dǎo)的骨髓巨噬細(xì)胞具備正常的吞噬功能，見圖2。

2.3不同濃度IL-22對骨髓來源巨噬細(xì)胞活力的影響 分別以2.5、5、10、20、40、80、160 ng/ml濃度的IL-22干預(yù)骨髓來源巨噬細(xì)胞36 h后，計算半抑制濃度值(IC50)，結(jié)果顯示IL-22對骨髓來源巨噬細(xì)胞的IC50為88.1 ng/ml,因此本實驗選擇IL-22的作用濃度為20 ng/ml，處于安全藥物濃度范圍內(nèi)，見圖3。

2.4IL-22可抑制M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá) 經(jīng)過7 d的誘導(dǎo)，CD11b+F4/80+細(xì)胞的比例為(99.3±0.4)%，成功獲得高純度的成熟M0型巨噬細(xì)胞，見圖4A。用LPS(1 μg/ml)刺激M0型巨噬細(xì)胞24 h，檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD11b+F4/80+iNOS+，實驗結(jié)果顯示CD11b+F4/80+iNOS+細(xì)胞的比例為(85.9±4.1)%，成功獲得M1型巨噬細(xì)胞。IL-22(20 ng/ml)干預(yù)M1型巨噬細(xì)胞36 h后，分別檢測LPS組、LPS+IL-22組M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，結(jié)果顯示，LPS+IL-22組CD11b+F4/80+iNOS+細(xì)胞的比例為(68.8.9±2.6)%，低于LPS組(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4B。

2.5IL-22可抑制M1型巨噬細(xì)胞IL-1β、TNF-α的分泌 IL-22干預(yù)M1型巨噬細(xì)胞36 h后，分別檢測兩組M1型巨噬細(xì)胞IL-1β、TNF-α分泌水平，結(jié)果顯示，與LPS組相比，LPS+IL-22組促炎細(xì)胞因子IL-1β[(431±47)vs(296±55)pg/ml，t=3.214，P=0.032]和TNF-α[(629±74)vs(274±24)pg/ml，t=7.896，P=0.001]分泌水平均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5。

2.6IL-22可抑制M1型巨噬細(xì)胞iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá) IL-22不同時間(12、24和36 h)干預(yù)M1型巨噬細(xì)胞，分別檢測M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與LPS組相比，LPS+IL-22組的促炎細(xì)胞因子iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)均有不同水平地降低，其中，TNF-α mRNA表達(dá)水平隨著IL-22干預(yù)時間延長而下降(P<0.01)；IL-1β和iNOS的24 h和36 h組mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義， 而iNOS 12 h組mRNA表達(dá)水平升高(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果證實IL-22可抑制巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的分泌，抑制炎性反應(yīng)，見圖6。

圖1 骨髓來源巨噬細(xì)胞形態(tài)(×200)Fig.1 Morphology of bone marrow-derived macrophagesNote: A.M0 macrophages;B.M1 macrophages(×200).

圖2 骨髓來源巨噬細(xì)胞吞噬乳膠微球(×200)Fig.2 Phagocytosis of latex beads by bone marrow-derived macrophages(×200)

圖3 不同濃度IL-22對骨髓來源巨噬細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of IL-22 on viability of bone marrow-derived macrophages

圖4 骨髓來源巨噬細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig.4 Flow cytometry analysis of bone marrow-deriv-ed macrophagesNote: A.Bone marrow-derived macrophages were first gated on FSC and SSC to remove debris and conjugates,mature M0 macrophages were defined as CD11b+F4/80+ subpopulations;B.M0 macropha-ges were induced by LPS for 24 h,and then treated with IL-22 for 36 h,M1 macrophages were defined as CD11b+F4/80+iNOS+ subpopulations;Compared with LPS group,**.P<0.01.

圖5 IL-22干預(yù)36 h對M1型巨噬細(xì)胞的IL-1β、TNF-α分泌水平的影響Fig.5 Effects of IL-22 on secretion of IL-1β and TNF-α in M1 macrophages after 36 h interventionNote: Compared with LPS group,*.P<0.05，**.P<0.01.

3 討論

肝纖維化是一種肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的病理過程[8]。肝纖維化的形成過程中，炎性反應(yīng)發(fā)揮關(guān)鍵性作用?？莘窦?xì)胞是位于肝竇內(nèi)的巨噬細(xì)胞，與其它炎癥細(xì)胞如浸潤性巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞都會導(dǎo)致肝臟炎癥，炎癥細(xì)胞激活HSC，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化[9,10]。在本研究中，從股骨分離得到的骨髓干細(xì)胞經(jīng)過M-CSF7 d的分化培養(yǎng)，CD11b+F4/80+細(xì)胞的比例非常高，與Ying等[11]的結(jié)果一致。本研究還通過吞噬乳膠微球?qū)嶒炞C實了M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞具備正常的吞噬功能。巨噬細(xì)胞分為促炎型(M1)和抗炎型(M2)。由IFN-γ和LPS誘導(dǎo)并表達(dá)促炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的M1型巨噬細(xì)胞參與肝纖維化的發(fā)病機制。M2型巨噬細(xì)胞由IL-4、IL-10和IL-13誘導(dǎo)并可分泌細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、PDGF和EGF，M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎作用，促進(jìn)傷口愈合[12]。本研究用LPS刺激骨髓來源巨噬細(xì)胞后，得到高比例的CD11b+F4/80+iNOS+細(xì)胞，該細(xì)胞高度表達(dá)相關(guān)促炎因子iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA，同時IL-1β和TNF-α的分泌量增多，呈典型的M1型巨噬細(xì)胞炎癥模型。

圖6 IL-22不同的干預(yù)時間對M1型巨噬細(xì)胞的iNOS、IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of different intervention time on expression of iNOS,IL-1β and TNF-α mRNA in M1 macrophagesNote: Compared with LPS group,*.P<0.05，**.P<0.01.

IL-22在調(diào)節(jié)炎性疾病相關(guān)的炎性反應(yīng)中具有重要作用[13],在控制細(xì)菌感染、調(diào)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)和對抗組織損傷等方面均具有重要作用[14]。在肝臟體內(nèi)和體外的研究中，IL-22通過STAT3對酒精性肝損傷起保護(hù)作用，參與肝切除術(shù)后肝增殖再生，在急性肝臟炎癥期間為肝細(xì)胞提供保護(hù)[5,15,16]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-22與HSC上的IL-22R1受體結(jié)合后夠誘導(dǎo)HSC的衰老，加速肝纖維化溶解，減輕纖維化程度;而STAT3、SOCS3、P53和Notch信號通路的激活可能是IL-22誘導(dǎo)HSC的凋亡、抑制肝纖維化進(jìn)展的主要機制[6]。但在肝臟研究中，對IL-22與巨噬細(xì)胞炎癥關(guān)系的研究少有報道。在本研究中，用IL-22干預(yù)M1型巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-22可不同水平抑制M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)促炎因子iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)，而且抑制作用隨著時間而遞增，IL-22減少M1型巨噬細(xì)胞的比例，降低細(xì)胞TNF-α、IL-1β的上清分泌水平。這一結(jié)果表明，IL-22可以作用于巨噬細(xì)胞，減少其炎性反應(yīng)。Luo等[17]的研究提示，肝纖維化組織中M1比M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量多，IL-22可促進(jìn)M0型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化，并上調(diào)STAT3表達(dá)水平，推測IL-22可能經(jīng)STAT3通路調(diào)控巨噬細(xì)胞來抑制肝纖維化發(fā)生發(fā)展。結(jié)合本研究猜想，IL-22可能通過STAT3通路減少M1型巨噬細(xì)胞比例，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的分化，從而減輕炎癥和發(fā)揮抗炎修復(fù)作用。

綜上所述，經(jīng)LPS刺激的骨髓來源巨噬細(xì)胞，細(xì)胞炎癥水平增高，IL-22可抑制其促炎癥因子的表達(dá)，減少M1型巨噬細(xì)胞比例，發(fā)揮抑炎作用。