五個抗稻瘟病基因在浙江省水稻品種中的分布和抗性評價

何海燕，柴榮耀，邱海萍，毛雪琴，王艷麗，孫國倉，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100080； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省植物有害生物防控重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

由稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)引起的稻瘟病是水稻三大病害之一，其暴發(fā)嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量及品質(zhì)。我國20世紀(jì)80—90年代以來流行年份發(fā)病面積超過600萬hm2，21世紀(jì)以來我國稻瘟病每年發(fā)病面積在480萬hm2左右。2014年稻瘟病發(fā)病嚴(yán)重，浙江省水稻種植區(qū)域稻瘟病單位發(fā)生面積達到2.33萬hm2，損失超過350 kg·hm-2[1]。除了特殊的氣候因素、稻瘟病預(yù)防措施不到位外，主栽品種抗性下降也是稻瘟病重發(fā)的重要原因，浙江、江蘇等地都出現(xiàn)了稻瘟菌優(yōu)勢種群的變化，導(dǎo)致原先抗病的品種突然感病[2]。因此選育抗病品種，并輪換種植是降低稻瘟病流行風(fēng)險的重要舉措。

目前，水稻育種家致力于培育抗性強及抗譜廣的水稻品種，一些已經(jīng)被定位和克隆的抗性基因，比如Pi9、Pi2、Pigm、Pi5、Pia等已經(jīng)在生產(chǎn)上廣泛運用。然而傳統(tǒng)的雜交、回交等育種技術(shù)周期長，篩選困難，給育種帶來一些阻礙。一些與稻瘟病抗性基因緊密連鎖或者源于抗性基因本身序列開發(fā)的特異性分子標(biāo)記，為快速、準(zhǔn)確、系統(tǒng)地鑒定水稻品種抗瘟基因型，以及高效開展抗稻瘟病基因聚合育種帶來了新的契機。Wang等[3]利用已克隆基因Pita的功能性分子標(biāo)記檢測水稻品種中Pita基因的攜帶情況，準(zhǔn)確有效而且效率頗高。華麗霞等[4]利用GenBank數(shù)據(jù)庫獲取Pi9、Pi2、Pizt全基因組序列，并且利用Seqman軟件比對日本晴基因組上等位感病基因序列，開發(fā)了Pi9、Pi2、Pizt抗性基因分子標(biāo)記，對101份水稻保持系、恢復(fù)系及常規(guī)稻品種進行了基因篩查。

孫國昌等[5]利用我國主要稻區(qū)的155個稻瘟菌株對13個粳稻品種(已知攜帶單抗性基因)的抗性水平進行了測定，發(fā)現(xiàn)對浙江省菌株的抗性情況表現(xiàn)為Pii>Pib>Pit>Pia，菌株毒力頻率分別為35.0%、48.1%、58.9%、88.0%。而20世紀(jì)80—90年代，不少基因的抗性發(fā)生了很大的變化，本研究利用Pit、Pib、Pii/Pi3/Pi5、Pia、Pi1五個稻瘟病抗性基因功能性分子標(biāo)記，對浙江省46個水稻主栽品種，包括秈型三系雜交稻、粳型三系雜交稻、秈型兩系雜交稻、粳型常規(guī)稻、秈型常規(guī)稻等進行了抗瘟基因檢測，并且對這些品種進行了稻瘟菌接種、抗苗瘟水平分析，旨在摸清浙江省水稻栽培品種中5個抗性基因攜帶情況及基因型，初步探討水稻抗性基因基因型和抗瘟水平的相關(guān)性，為浙江省稻區(qū)抗病育種和合理布局提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料及種植條件

本研究所用的水稻品種包括陽性對照材料麗江新團黑谷單基因系品種7個，為Pit、Pib、Pii、Pi3、Pi5、Pia、Pi1基因供體品種IRBt-K59、IRBLb-B、IRBLi-F5、IRBL3-CP4、IRBL5-M、IRBLa-A和IRBL1-CL(由糧食作物“基因?qū)颉辈『r(nóng)業(yè)農(nóng)村部行業(yè)專項提供)；陰性對照材料麗江新團黑谷1份，浙江省水稻主栽品種40份，稻瘟菌鑒別品種6份，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物與微生物研究所提供，如表1所示。

將水稻種子置于28 ℃浸種2 d后，32 ℃催芽48 h，選取發(fā)芽良好的種子穴播于盛有肥沃土壤的育苗盆內(nèi)，穴間距為5 cm左右，每穴播種發(fā)芽良好的種子10粒左右，每盆中分別設(shè)感病對照1份，各重復(fù)內(nèi)品種采用隨機排列；2葉期定苗酌施氮肥，促苗以利于做接種試驗。在溫室中培養(yǎng)14 d后，進行樣品采集和接種。

1.2 病原菌材料、培養(yǎng)及接種調(diào)查

1.2.1 菌株來源、活化、繁殖和產(chǎn)孢

本試驗采用2016-42-1、2016-36-2、2017-41-3等141個菌株，所有菌株分離自2015—2017年浙江各地采集的稻瘟菌標(biāo)樣。菌株活化后接種于CM固體培養(yǎng)基上，28 ℃，12 h光暗交替培養(yǎng)10 d后，加入無菌水洗刷孢子，用血球計數(shù)板將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至約2×105mL-1的濃度，作為苗期噴霧的接種體。

1.2.2 水稻噴霧接種和發(fā)病調(diào)查

水稻生長14 d左右，即在幼苗三葉一心期，在孢子懸浮液中加入0.5%～0.8%的明膠進行噴霧接種，每100株苗約30 mL；于26 ℃下黑暗保濕24 h，然后移至28 ℃的高濕(用噴霧器進行不定時噴霧)環(huán)境下培育。

表1 供試水稻材料

Table1Rice cultivars used in this study

編號品種名稱編號品種名稱編號品種名稱No.Cultivar nameNo.Cultivar nameNo.Cultivar name1Ⅱ優(yōu)650 II you 65019秀優(yōu)378 Xiuyou 37837寧88 Ning 882Y兩優(yōu)2號 Y liangyou 220浙粳99 Zhegeng 9938甬優(yōu)1540 Yongyou 15403寧81 Ning 8121甬優(yōu)12 Yongyou 1239甬優(yōu)9號 Yongyou 94Y兩優(yōu)1號 Y liangyou 122甬優(yōu)15 Yongyou 1540春優(yōu)927 Chunyou 9275Y兩優(yōu)689 Y liangyou 68923甬優(yōu)17 Yongyou 1741合江18 Hejiang 186春優(yōu)84 Chunyou 8424甬優(yōu)538 Yongyou 53842四豐43 Sifeng 437豐兩優(yōu)香1號 Fengliangyouxiang 1 25甬優(yōu)8 Yongyou 843東農(nóng)363 Dongnong 3638嘉58 Jia 5826粵優(yōu)938 Yueyou 93844關(guān)東51 Guandong 519EX11927浙優(yōu)12 Zheyou 1245TTP10浙粳86 Zhegeng 8628浙糯優(yōu)1號 Zhenuoyou 146珍龍13 Zhenlong 1311內(nèi)五優(yōu)8015 Neiwuyou 801529中浙優(yōu)1號 Zhongzheyou 147IRBLt-K59(Pit)12錢優(yōu)0508 Qianyou 050830中浙優(yōu)8 Zhongzheyou 848IRBLb-B(Pib)13錢優(yōu)1號 Qianyou 131浙粳70 Zhegeng 7049IRBL5-M(Pi5)14錢優(yōu)930 Qianyou 93032甲農(nóng)糯 Jianongnuo50IRBLa-A(Pia)15紹糯9714 Shaonuo 971433秀水519 Xiushui 51951IRBL1-CL(Pi1)16深兩優(yōu)5814 Shenliangyou 581434寧84 Ning 8452IRBLi-F5(Pii)17秀水12 Xiushui 1235秀水134 Xiushui 13453IRBL3-CP4(Pi3)18秀水321 Xiushui 32136嘉禾218 Jiahe 218

編號1-40為浙江省主栽品種，編號41-46為稻瘟菌鑒別品種，編號47-51為麗江新團黑谷單基因系。下同。

No. 1-40 were the main cultivars in Zhejiang Province， No. 41-46 were the identification cultivars of rice blast， No. 47-53 were LTH monogenic line. The same as below.

接種7 d后參照國際稻瘟病苗瘟調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)[6]調(diào)查發(fā)病情況?？剐灶l率(%)為水稻材料在稻瘟菌接種中表現(xiàn)抗性菌株數(shù)與總測定菌株數(shù)目之比。

1.2.3 樣品采集及DNA提取

每個品種采集1個單株的2 cm長葉片，放置2 mL離心管(提前放置2～3顆鋼珠)中，用TPS法抽提水稻葉片總DNA。加入100 μL ddH2O(含RNA酶)溶解，37 ℃溫浴40 min，然后-20 ℃保存。

1.3 Pit、Pib、Pii/Pi3/Pi5、Pia、Pi1等5個基因特異性分子標(biāo)記與檢測

1.3.1 基因特異性分子標(biāo)記

抗性基因Pit等5個抗性基因使用分子標(biāo)記的引物序列及擴增多態(tài)性差異見表2。引物由上海擎科生物技術(shù)公司合成。

1.3.2 基因特異性分子標(biāo)記的檢測

檢測采用PCR擴增方法。用20 μL PCR反應(yīng)體系，含1 μL(40 ng)模板DNA，0.5 μL正向引物(10 μmol·L-1)，0.5 μL反向引物(10 μmol·L-1)，10 μL 2×TSINGKE Master Mix，8 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 kb·min-1，35個循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。凝膠電泳拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙江省各主栽品種、稻瘟菌鑒別品種和麗江新團黑谷單基因系抗性頻率

本研究對40個浙江省主栽品種，6個稻瘟菌鑒別品種，以及7個含有對應(yīng)抗性基因的麗江新團黑谷單基因系進行了苗期抗性測定。結(jié)果在40個浙江省水稻主栽品種中，秀水321和浙優(yōu)12兩個品種抗性頻率達到80%以上，占比為5%；Y兩優(yōu)1號、浙粳86等13個品種抗性頻率在70%～80%，占比為32.50%；Y兩優(yōu)689、內(nèi)五優(yōu)8015等7個品種抗性頻率在60%～70%，占比為17.50%。5個稻瘟病鑒別品種中，抗性頻率最高的是TTP，為54.61%；抗性頻率最低的是合江18，為26.95%。7個麗江黑谷單基因系中，抗性頻率最高的是IRBL1-CL(Pi1)和IRBLt-K59(Pit)，分別為34.75%和32.62%；抗性頻率最低的是IRBLb-B(Pib)，為9.93%。其余幾個單基因系的抗性頻率為15%～31%。鑒定結(jié)果如表3所示。

表2 用于PCR反應(yīng)的分子標(biāo)記

Table2Functional markers used for resistant gene amplification

基因引物名稱引物序列片段大小抗感性GenePrimer namePrimer sequence(5′-3′)Fragment size/bpResistance and sensibilityPit[7]tRn1F: GTTGGAGCTACGGTTGTTCAG733抗病ResistantR: ATGATAACCTCATCCTCAATAAGTPib[8-9]PibdomF: GAACAATGCCCAAACTTGAGA365抗病ResistantR: GGGTCCACATGTCAGTGAGCLys145F: GAACAATGCCCAAACTTGAGA803感病SusceptibleR: GGGTCCACATGTCAGTGAGCPii/Pi3/Pi5[10]JJ113-T3F: GAACAATGCCCAAACTTGAGA484抗病ResistantR: GGGTCCACATGTCAGTGAGCPia[11]M-PiaF: GAACAATGCCCAAACTTGAGA148/189InDel抗病/感病 Resistant/SusceptibleR: GGGTCCACATGTCAGTGAGCPil[12]M-Pi1F: GAACAATGCCCAAACTTGAGA460抗病ResistantR: GGGTCCACATGTCAGTGAGC

2.2 浙江省主栽品種和稻瘟菌鑒別品種抗瘟基因型及其分布

利用已建立的分子鑒別體系對46個浙江省主栽水稻品種和稻瘟病鑒別品種的基因分布情況進行了研究，獲得了部分稻瘟病抗性基因的分布情況(表4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這46個品種中，有5個品種攜帶Pit抗病基因，有29個品種攜帶Pib抗病基因，有8個品種攜帶Pii/Pi3/Pi5抗病基因，有27個品種攜帶Pia抗病基因，有1個品種攜帶Pi1抗病基因。部分基因抗性分子標(biāo)記檢測結(jié)果如圖1所示。

在檢測的水稻品種中，抗性基因Pib和Pia分布頻率最高，分別為63.04%和58.70%；其次是抗性基因Pii/Pi3/Pi5和Pit，分別為21.74%和10.87%。檢測的浙江省主栽品種都不攜帶Pi1基因，僅稻瘟菌鑒別品種TTP攜帶該基因。各個抗性基因分布頻率如圖2所示。

2.3 浙江省水稻品種中含檢測抗瘟基因數(shù)量

對40個浙江省水稻主栽品種和6個稻瘟菌鑒別品種檢出的稻瘟病抗性基因進行數(shù)量分析，Ⅱ優(yōu)650、春優(yōu)84、嘉58等7個品種同時攜帶了3個抗病基因，占檢測品種比率為15.22%；Y兩優(yōu)689、內(nèi)五優(yōu)8015和紹糯9714等16個品種同時攜帶了2個抗病基因(其中1個為稻瘟菌鑒別品種)，占測試品種的34.78%；有19個品種僅攜帶了1個抗病基因(其中4個為稻瘟菌鑒別品種)，占測試品種的41.30%；還有4個品種未攜帶任何抗病基因(其中1個為稻瘟菌鑒別品種)，其比率為8.70%(圖3)。

表3 浙江省主栽品種、稻瘟菌鑒別品種和麗江新團黑谷單基因系抗性頻率

Table3Resistance frequency of main cultivars in Zhejiang， rice blast identification cultivars and LTH monogenic line

編號抗性頻率編號抗性頻率編號抗性頻率編號抗性頻率編號抗性頻率編號抗性頻率No.Resistancefrequency/% No.Resistancefrequency/% No.Resistancefrequency/% No.Resistancefrequency/% No.Resistancefrequency/% No.Resistancefrequency/% 148.941079.431963.832853.903779.434646.10259.571165.962079.432952.483878.014732.62343.261267.382174.473073.053956.03489.93475.891348.232254.613174.474065.964930.50565.251453.192359.57327.804126.955018.44676.601558.872473.053370.214227.665134.75730.501671.632544.683464.544350.355221.28867.381758.162638.303574.474442.555316.31921.281881.562781.563627.664554.61

品種編號與表1一致。

The No. of rice cultivars was consistent with those in Table 1.

M，DL2000；A，Pit基因抗性分子標(biāo)記檢測，CK，IRBLt-K59；B1，Pib基因抗性分子標(biāo)記檢測；B2，Pib基因感性分子標(biāo)記檢測，CK，IRBLb-B；C，Pii/Pi3/Pi5基因抗性分子標(biāo)記檢測，CK，IRBL5-M；D，Pia基因抗性分子標(biāo)記檢測，CK，IRBLa-A；E，Pi1基因抗性分子標(biāo)記檢測，CK，IRBL1-CL。泳道2，麗江新團黑谷；泳道1-12，部分浙江省主栽品種材料，依次為II優(yōu)650、Y兩優(yōu)2號、寧81、Y兩優(yōu)1號、Y兩優(yōu)689、春優(yōu)84、豐兩優(yōu)香1號、嘉58、EX119、浙粳86、內(nèi)五優(yōu)8015、錢優(yōu)0508。M， DL2000; A， Identification of Pit with resistance molecular markers， CK， IRBL5-M; B1， Identification of Pib with resistance molecular markers， B2， Identification of Pib with susceptible molecular markers， CK， IRBLb-B; C， Identification of Pii/Pi3/Pi5 with resistance molecular markers， CK， IRBL5-M; D， Identification of Pia with resistance molecular markers， CK， IRBLa-A; E， Identification of Pi1 with resistance molecular markers， CK， IRBL1-CL. Lane 2， Negative control， LTH; Lane 1-12， Some main varieties of Zhejiang Province， II you 650， Y liangyou 2， Ning 81， Y liangyou 1， Y liangyou 689， Chunyou 84， Fengliangyou 1， Jia 58， EX119， Zhegeng 86， Neiwuyou 8015， Qianyou 0508， respectively.圖1 五個稻瘟病基因抗性分子標(biāo)記檢測Fig.1 Detection of 5 rice blast resistance genes by specific molecular markers

表4Pit、Pib、Pii/Pi3/Pi5、Pia和Pi1基因在浙江省主栽品種和稻瘟病抗性品種中的分布及基因型

Table4Distribution and genotypes ofPit，Pib，Pii/Pi3/Pi5，PiaandPi1 in main cultivars in Zhejiang， and rice blast identification cultivars

品種Cultivar基因GenePit PibPii/Pi3/Pi5PiaPi1品種Cultivar基因GenePitPibPii/Pi3/Pi5PiaPi1Ⅱ優(yōu)650 Ⅱ you 650R_SSR_RRSS甬優(yōu)538 Yongyou 538SSRRSSRSSSY兩優(yōu)2號 Y liangyou 2SSSSSSRSSS甬優(yōu)8 Yongyou 8SSRRSSRSSS寧81 Ning 81SSRRSSSSSS粵優(yōu)938 Yueyou 938SSSSSSRRSSY兩優(yōu)1號 Y liangyou 1SSSSSSRSSS浙優(yōu)12 Zheyou 12SSRRSSSSSSY兩優(yōu)689 Y liangyou 689SSRSSSRSSS浙糯優(yōu)1號 Zhenuoyou 1SSRRSSRRSS春優(yōu)84 Chunyou 84SSRRR_RSSS中浙優(yōu)1號 Zhongzheyou 1SSRSR_RRSS豐兩優(yōu)香1號 Fengliangyouxiang 1 SSRSR_SSSS中浙優(yōu)8 Zhongzheyou 8SSSSR_RRSS

續(xù)表4

RR，純和抗病基因型；SS，感病純和基因型；RS，雜合基因型；R_:不明確純合還是雜合的抗病基因型。

RR， Resistant homozygous genotype; SS， Susceptible homozygous genotype; RS， Heterozygous genotype; R_: Resistant genotype with unclear homozygosity or heterozygosity.

圖2 五個抗稻瘟病基因在浙江水稻品種中的分布Fig.2 Distribution of 5 rice resistant genes in rice varieties in Zhejiang

圖3 各水稻品種所含抗性基因數(shù)及其所占比率Fig.3 Number of blast resistance genes detected in each rice variety and the percentage

3 討論

自20世紀(jì)70年代，中外學(xué)者對水稻品種中含有的抗性基因進行分析歸類。山崎等[13]發(fā)現(xiàn)抗性基因Pia普遍存在于愛知旭等日本品種中，后來又發(fā)現(xiàn)該基因也分布于韓國、中國等東南亞國家水稻品種中，而且在美國播種的水稻品種中也有發(fā)現(xiàn)，說明該基因分布相當(dāng)廣泛。同時，山崎等[13]對石狩白毛品種進行抗性分析，在該品種中發(fā)現(xiàn)抗性基因Pii。美國學(xué)者Yi等[10]在研究中發(fā)現(xiàn)Pi5、Pi3和Pii位于染色體相近位置，且抗譜比較接近，推測3個基因等位或連鎖緊密。本研究發(fā)現(xiàn)，Pi5基因的顯形標(biāo)記適用于其他2個基因，然而3個分別攜帶Pi5、Pi3和Pii基因的麗江新團黑谷單基因系材料抗譜并不一致，Pi5基因的抗性頻率明顯較后兩者高，說明這3個基因在進化歷程中分化比較晚，對稻瘟病菌的抗性卻有了明顯的差異；值得做進一步比較分析，開發(fā)能區(qū)分3個基因的特異性分子標(biāo)記。本研究同時分析了46個水稻品種中5個抗性基因位點的攜帶情況，發(fā)現(xiàn)品種浙粳99和浙優(yōu)12僅檢測到其中1個抗性基因，抗性頻率分別達到了79.43%和81.56%；說明這兩個品種中可能還存在其他抗病基因，顯著提升了品種的抗病水平，值得進行進一步研究。研究中發(fā)現(xiàn)Pib基因在浙江省主栽品種中分布非常廣，72.5%的浙江省主栽品種攜帶該基因，然而該基因的抗性頻率非常低，僅9.93%，說明這個基因?qū)?年浙江省品種的抗瘟水平的貢獻非常小，有可能是該基因在過去的某些年里發(fā)揮過重要的抗瘟作用，然而近幾年稻瘟菌菌株普遍克服了該抗性基因分泌的效應(yīng)蛋白。這可能也是某些水稻品種抗瘟水平下降的原因，比如品種寧81，經(jīng)檢測僅攜帶該抗性基因，其抗性頻率偏低，為43.26%。張善磊等[14]利用分子標(biāo)記對包含167份長江中下游地區(qū)粳稻品種(系)在內(nèi)的200多份粳稻材料中的4個稻瘟病抗性基因進行了分布情況分析，發(fā)現(xiàn)長江中下游材料中有44.31%攜帶Pib基因。在38份只攜帶Pib基因的品種(系)中，33份表現(xiàn)為中感或高感穗頸瘟(感病率為86.84%)。這與本研究結(jié)果基本一致。在該研究中，作者還發(fā)現(xiàn)，Pi5基因在東北、華北、長江中下游、西北和西南稻區(qū)都有一定數(shù)量的分布，在日韓的粳稻品種中也有不低的分布水平，說明該基因分布相當(dāng)廣；30份僅含Pi5單基因的品種中，19份感病(感病率為63.33%)。這與本研究結(jié)果也是基本一致的。

本研究中的5個抗性基因麗江黑谷單基因品系抗性頻率都不高(都沒有達到40%)，但是本研究中77.5%浙江省品種的抗性水平都超過了50%，說明抗性基因的聚合顯著提高了品種的抗瘟水平，這也和目前倡導(dǎo)的多基因聚合抗稻瘟病育種的思路相符。浙江省稻區(qū)屬于秈稻粳稻混栽區(qū)，稻瘟病菌群結(jié)構(gòu)也較復(fù)雜[15]，一個抗性品種推廣數(shù)年常會引起菌群小種結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致品種抗性喪失。水稻品種抗稻瘟基因分析是抗病育種和抗病品種合理利用的基礎(chǔ)性工作，目前這項工作仍有待加強[5]。水稻與稻瘟菌長期協(xié)同進化過程中形成了兩種免疫機制[16]，即稻瘟菌相關(guān)分子誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)機制(PAMP-triggered immunity，PTI)和稻瘟菌效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)機制(effector-triggered immunity，ETI)。其中明晰抗稻瘟病基因與其對應(yīng)的無毒基因是認(rèn)識ETI免疫機制的關(guān)鍵[17]。目前已經(jīng)有包括Pi25[18]、Pi35[19]、Pi36[20]和Pi37[21]在內(nèi)的20多個抗瘟基因被克隆，也有PWL1[22]、PWL2[23]、AvrPi-ta[24]和AvrPi-zt[25]等10個無毒基因被克隆，而且不少于4對R基因和Avr基因的互作模式已被闡述[18]。在抗稻瘟育種方面也有更多新的策略可以選擇；比如全基因選擇育種和靶基因調(diào)控育種。Zhao等[26]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定了5個抗性基因位點，Kang等[27]在其基礎(chǔ)上又鑒定了66個稻瘟病抗性位點，這些都成為全基因組選擇育種的基礎(chǔ)。將新開發(fā)的水稻抗瘟育種技術(shù)同常規(guī)育種程序科學(xué)地結(jié)合起來，發(fā)展出一套高效、系統(tǒng)便于育種家利用的技術(shù)體系是未來育種的新思路，然而仍有不少難題有待克服。