人甲母質細胞無血清原代培養(yǎng)方法的建立

陳朝豐 于波 呂超 劉曉云 胡小平

北京大學深圳醫(yī)院皮膚科，深圳 518036

指（趾）甲是由外胚層分化而來的皮膚附屬結構，對肢端具有保護、可協(xié)調完成精細動作等作用［1］。在胚胎第20周，甲單位發(fā)育完成［2］。甲板外觀主要受甲母質細胞的特殊分化功能決定。目前關于甲器官的研究已取得一定的進展。如甲干細胞的識別［3］、甲器官分化和內穩(wěn)態(tài)相關信號通路的研究［4］、甲干細胞再生潛能的探索［5］等，但這些研究基本局限于組織水平或動物實驗階段。因此，建立起人甲母質細胞無血清原代培養(yǎng)方法，有利于多種甲病機制的研究及治療方法的探究。

材料與方法

一、標本來源

人甲母質組織選自北京大學深圳醫(yī)院2016年1-12月就診的9 例多指（趾）畸形、要求行指（趾）切除的患者或甲溝炎要求行甲床修整術的患者，所有行甲床修整術的患者均為擇期手術，外用及系統(tǒng)服用抗生素治療甲溝炎，在炎癥消除后再進行手術。本研究通過北京大學深圳醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準號2016025），所有患者均簽署知情同意書。

二、主要試劑及儀器

胎牛血清白蛋白、DEME 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）干粉、2.5%胰蛋白酶（美國Thermo 公司），無血清的角質形成細胞生長培養(yǎng)基（CnT-07，瑞士CELLnTEC公司），鼠抗人細胞角蛋白10（K10）單克隆抗體、兔抗人細胞K5單克隆抗體（英國Abcam公司），F(xiàn)ITC488 標記山羊抗大鼠 IgG 二抗、DyLight 649 標記山羊抗兔IgG 二抗（上海英駿生物技術有限公司），F(xiàn)ITC 標記的鼠抗人K10抗體（英國Novus公司），Triton X-100（德國Sigma公司），流式細胞儀（美國Beckman公司）。

三、甲母質細胞原代培養(yǎng)及傳代

將手術中獲得的指（趾）組織拔除甲板，盡量去除甲母質區(qū)的表皮及皮下組織，用手術刀切下遠離甲床部位的甲母質組織，放入含有生理NaCl 溶液的無菌標本瓶中，剩余的廢棄組織由手術室統(tǒng)一處理。取甲母質組織塊用75%乙醇浸泡5 min，PBS沖洗5次，將甲母質組織分成約2 mm3的組織塊，放置在60 mm 一次性培養(yǎng)皿中，每塊組織塊間隔2 cm，用無菌移液槍頭輕壓組織塊，使其與塑料培養(yǎng)皿充分接觸5 min。待組織塊與皿底充分粘合后，加入2 ml 無血清DEME/F-12 培養(yǎng)基，浸沒組織塊。培養(yǎng)皿放置在37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察組織塊邊緣的細胞增長情況，培養(yǎng)5～7 d后換用無血清的角質形成細胞生長（CnT-07）培養(yǎng)基，2～3 d換液1次。原代單層細胞增長達60%～70%時，用含0.25%胰蛋白酶、0.03%EDTA 的PBS 消化，制備單細胞懸液用于傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中采用倒置顯微觀察細胞形態(tài)。單細胞懸液的最終密度為5×106/ml～1×107/ml時用于后續(xù)實驗，剩余細胞與含10%二甲基亞砜的胎牛血清凍存培養(yǎng)液1∶1 混合，分裝在凍存管中，每管1.5 ml，置于-80 ℃冰箱中保存。

四、免疫熒光觀察細胞角蛋白的表達情況

將單細胞懸液均勻接種到放置有15 mm 蓋玻片的12 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h，待細胞密度達到60%～70%去除培養(yǎng)液，PBS浸洗3次。用4%甲醛溶液固定15 min，PBS浸洗3次，用0.5%Triton X-100（PBS 配制）室溫通透20 min，PBS 浸洗3 次，滴加1%牛血清白蛋白（BSA），37 ℃封閉30 min，加入K10 抗體和K5 抗體，放入濕盒于4 ℃孵育過夜。加入熒光二抗（FITC488標記山羊抗大鼠IgG二抗、DyLight649標記山羊抗兔IgG二抗，1∶100），室溫濕盒中孵育2 h；滴加4，6二氨基-2-2苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）對細胞進行核染，避光孵育5 min；PBS 浸洗玻片3 次，加入含抗熒光猝滅劑的封片液，中性樹膠封片，在熒光倒置顯微鏡下采集圖像及判定結果。

五、流式細胞儀檢測甲母質細胞的純度

取 1 × 106/ml 的單細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑15 cm），去除上清液，加入50 μl 1%的鼠抗人K10單克隆抗體混勻，4 ℃孵育30 min，PBS 清洗細胞，1 000 r/min 離心 5 min（離心半徑15 cm），棄上清液，加入50 μl 1%的FITC488 標記山羊抗大鼠IgG 二抗混勻，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗細胞后，用細胞濾膜過濾2次，上機檢測。

結 果

一、原代培養(yǎng)甲母質細胞時細胞的生長情況

甲母質組織塊種植2～3 d后，有少量細胞從組織塊邊緣爬出，細胞形態(tài)小而圓或呈長梭形；第5～6 天，細胞繼續(xù)增殖，局部形成小的細胞團塊；第8天時，最外緣細胞距離甲母質細胞的距離不斷增大；第10天時，在甲母質組織塊周邊形成了較大的細胞團塊，部分細胞形態(tài)為上皮樣細胞，呈鋪路石樣排列，細胞間緊密連接，也有部分細胞呈扁平狀，形態(tài)為紡錘形或星形。見圖1。培養(yǎng)2～3 周后，細胞生長到培養(yǎng)瓶底的70%～80%，呈單層生長。培養(yǎng)第20天時，大部分細胞呈鋪路石樣排列，也可見少量細胞呈紡錘形或星形，細胞的體積較大，大部分細胞的大小可達50～ 100 μm（圖2）。當生長到培養(yǎng)瓶底的70%～80%，細胞密度達1 ×106～1×107/L時即可傳代。

二、原代甲母質細胞角蛋白表達情況

倒置熒光顯微鏡下顯示，K5、K10 均表達于細胞質中，K10 為綠色熒光，K5 為紅色熒光，K10 與K5 共染時為黃色熒光。亦有部分細胞未見K5、K10。見圖3。

圖1 甲母質細胞原代甲培養(yǎng)第5、8、10天時顯微鏡下的細胞形態(tài)（×100） 甲母質組織（不規(guī)則陰影部分）邊緣的細胞團塊隨時間不斷增大，部分細胞呈鋪路石樣外觀，部分呈紡錘形及星形

圖2 共聚焦顯微鏡下原代甲母質細胞的基本形態(tài) 少量細胞呈紡錘形或星形，細胞的體積較大，大部分細胞的大小可達50～100 μm。圖中比例尺單位為200 μm

圖3 熒光顯微鏡下原代甲母質細胞角蛋白5（K5）、K10表達情況 K10為綠色熒光，K5為紅色熒光，K10與K5共染時為黃色熒光，亦有部分細胞未表達K5、K10

三、流式細胞儀觀察原代甲母質細胞中K10的表達情況

流式細胞儀可檢測到以K10 為標記的陽性甲母質細胞的存在，甲母質細胞的比例約37.6%。見圖4。

討 論

圖4 流式細胞儀檢測以角蛋白10（K10）為標記的甲母質細胞比例 4A：以生理NaCl 溶液代替FITC488 標記山羊抗大鼠IgG二抗作對照；4B：K10陽性的甲母質細胞的比例約37.6%

甲母質是甲器官的主要組成部分［6］，可分化形成完全角質化的甲板［7］，近端甲母質參與甲板表層的形成，而遠端甲母質主要生成甲板深層，中間區(qū)域的甲母質生成了甲板的中間層［8］。當甲母質細胞受干擾時，病變可在甲板上表現(xiàn)出來。建立甲母質細胞的體外培養(yǎng)方法，有利難治療性甲病的研究及臨床治療。

目前，國內外關于甲母質細胞原代細胞的報道甚少，本實驗采用無血清培養(yǎng)基，可避免血清培養(yǎng)基能為細胞提供生長所需的生長因子、激素及營養(yǎng)物質等，但血清培養(yǎng)基的生產存在差異，不能保證批次間的差異，難以保證實驗條件的標準化，無血清培養(yǎng)基能盡可能地減少以上干擾因素的影響，使細胞的性能更加一致，功能的評估更加精確，提高了實驗結果的重復性。本研究選用無血清CnT-07作為培養(yǎng)基，細胞生長活性高，貼壁狀態(tài)好。因此，認為該培養(yǎng)基可用于甲母質細胞體外培養(yǎng)。

角蛋白可分為軟角蛋白和硬角蛋白，硬角蛋白是組成毛發(fā)及甲的主要結構［9］。根據(jù)凝膠雙向電泳和分子量的差異，將軟角蛋白分為酸性（Ⅰ型）角蛋白和堿性（Ⅱ型）角蛋白［10］。特定的酸性角蛋白和堿性角蛋白是等量配對分布的，K5、K14 是配對分布的［11］，主要在復層鱗狀上皮基底層和毛囊基質的角質形成細胞里表達［3］，K1 和 K10 也是配對分布，主要存在于正常皮膚的基底層中，與角質形成細胞的角化相關［2］。角蛋白的表達表現(xiàn)出了在組織、部位和時空上的特異性［12］。既往研究發(fā)現(xiàn)，K1、K10 可在甲母質組織中表達，在甲床中未被檢測到［13-14］，K10 可做為甲母質細胞的標記物，K1、K10、K5、K14 可在甲母質細胞、正常皮膚及甲下皮中表達，而在甲床中不表達，K5、K10同時表達陽性的細胞只有甲母質、皮膚及甲下皮［13，15］。本研究中，我們在甲母質取材過程時選取了遠離皮膚及甲下皮的甲母質組織進行培養(yǎng)，可排除甲下皮及皮膚細胞污染甲母質細胞，培養(yǎng)后細胞中K5、K10 陽性反應幾乎是重疊的，可確定為甲母質細胞。

本研究采用組織塊培養(yǎng)法，將甲母質細胞直接從組織中分離，傳代數(shù)少，可最大限度保持人甲母質細胞特有的生物學特性。但因組織塊組成復雜，少量成纖維細胞即可導致雜質細胞的出現(xiàn)。成纖維細胞在培養(yǎng)過程中易生長且生長速度快，結果中有部分細胞不表達K5、K10，采用K10對細胞標記，分析人原代甲母質細胞的純度約37.6%。推測這部分雜質細胞主要為成纖維細胞。

本研究通過探索人原代甲母質細胞的培養(yǎng)，為進一步實驗提供了基礎及條件。雖然培養(yǎng)所得的人原代甲母質細胞仍有其他雜質細胞，在后續(xù)研究中可采用流式細胞儀分選和免疫磁珠分選法純化細胞。本研究建立的人甲母質細胞原代培養(yǎng)的方法，可用于進一步了解人原代甲母質細胞的生物特性，并從細胞水平了解甲母質細胞受外界因素干擾下產生的不同反應，探索甲母質細胞生長及調控機制異常出現(xiàn)的生理生化反應，以期為闡明臨床難治性甲病的發(fā)病機制及臨床治療提供理論基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突